| Code No. | 包装単位 | 希望納入価格 |
|---|---|---|
| 312-06291 | 25回分 |
20,000円 |
| 318-06293 | 5回分 |
5,600円 |
目的の遺伝子をベクターDNAに連結する際に適当な制限酵素がない場合、DNA末端が平滑であれば配列に依存することなくライゲーションすることができます。T4 DNA Polymeraseは、DNA依存性DNAポリメラーゼで、3’→5’ Exonuclease活性と5’→3’ Polymerase活性を持ち、5’突出末端及び3’突出末端のどちらの場合もこの酵素で平滑化することができます。また、ライゲーション反応を短時間で行うことができる2×Ligation Mix ( Ligation-Convenience Kit )と組み合わせることによって、平滑化からライゲーションまでを短時間で行うことができます。
・DNA末端の平滑化からライゲーションまでを迅速、簡便に行うことが出来ます。
・10×Blunting Bufferには反応に必要なdNTPなどが含まれているので、T4 DNA Polymeraseを加えるだけで、簡単にDNA末端の平滑化が行えます。
・5’突出末端DNA, 3’突出末端DNAおよび3’末端にAが付加したPCR産物などを平滑化できます。
・2×Ligation Mixを用いて、ライゲーション反応を短時間で行うことができます。
1) 平滑化反応液の調製
5’突出末端、3’突出末端及びPCR産物など、末端を平滑化したいDNA（DNA末端濃度で0.1～10pmol)を17μlに調製する。
次に、10×Blunting Bufferを2μl加え混合する。
2) 酵素の添加
T4 DNA Polymeraseを1μl加え、ピペッティングで混合する。
3) 平滑化反応
37℃で5分間反応させる。
4) 反応の停止
平滑化反応液を氷中に置き反応を停止する。
すぐに使用しない場合はフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出、エタノール沈澱を行い−20℃で保存する。
5) ライゲーション反応液の調製
平滑化反応液、平滑末端DNAベクター溶液、を合わせて10μlのDNA溶液を調製する。
10μlの2×Ligation Mixを添加し、混和する。
6) ライゲーション反応
16℃で5～30分間反応させる。
7) 形質転換
反応液をそのまま形質転換に用いる。
製品マニュアルをご覧になる際にはAdobe Acrobat® ReaderまたはAdobe Acrobat® Reader Plug-inが必要です。
Code No. |
製品名 |
包装単位 |
希望納入価格(円) |
| 316-06233 | ECOS™ Competent E.coli DH5α | 100μl×20本 | 36,000 |
| 313-06243 | ECOS™ Competent E.coli JM109 | 100μl×20本 | 36,000 |
| 314-06251 | Bac'n' Roll Beads | 100回分 | 4,400 |
| 312-01551 | T4 Polynucleotide Kinase | 1,000 units | 13,000 |
| 319-05961 | Ligation-Convenience Kit | 100回分 | 20,000 |
| 311-90151 | Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) | 250 ml | 15,000 |
| 316-90025 | TE (pH8.0) | 500 ml | 9,000 |
| 314-90021 | TE (pH8.0) | 100 ml | 4,000 |
| 310-90023 | TE (pH8.0) | 100 ml×6 | 15,600 |
| 318-90105 | Distilled Water, Deionized, Sterile | 500 ml | 9,000 |
| 316-90101 | Distilled Water, Deionized, Sterile | 100 ml | 4,000 |
| 312-90103 | Distilled Water, Deionized, Sterile | 100 ml×6 | 15,600 |
●ベクター平滑化の確認
1) pUC19をEcoR I （5’突出末端）とPst I （3’突出末端）で切断し、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出後、TEバッファーに溶解した。
2) EcoR I とPst I で切断したpUC19 1μgをプロトコルに従って末端を平滑化した。
3) 平滑化したDNAの一部を2×Ligation Mixを用いて16℃ 30分間ライゲーション反応を行った。
4) ライゲーション反応後、未切断のpUC19を除きバックグラウンドをなくすため、ライゲーション反応液を5倍希釈し65℃ 5分間熱処理することでT4 DNA Ligaseを失活させた後、BamH I で切断した。
5) BamH I で切断したライゲーション反応液でECOS™ Competent E.coli DH5αを形質転換し、生じたコロニー数を計測した。
下にpUC19で形質転換したときのコロニー数を1としたときの、平滑化後セルフライゲーションによって生じたコロニー数の割合を示す。
結果
pUC19をEcoR I とPst I で切断したベクターを平滑化し、セルフライゲーションすると、LacZのフレームが合い青コロニーを生じる。BamH I で切断することで、pUC19由来の青コロニーは排除されているので、生じた青コロニーは末端平滑化後にセルフライゲーションでできたプラスミドである。
左記のグラフより、5分間の反応で約6割のベクターが平滑末端ライゲーションされていることがわかる。
1) pBluescript II SK(＋)をEcoRV で切断し脱リン酸化後、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出後にTEに溶解した。
2) λDNAを鋳型にして増幅した500bpの断片をEcoR I 及びPst I で切断し、2種類の断片を調製した。
3) プロトコルに従って、2種類の断片を平滑化した。
4) pBluescript II SK(＋)をEcoRV で切断し脱リン酸化したベクターと平滑化した断片を2×Ligation Mixを用いてインサート/ベクターモル比=5で16℃ 30分間ライゲーション反応を行った。また、コントロールとしてλDNAを鋳型にして増幅した断片をEcoR V で切断した断片のライゲーション反応も行った。
5) ライゲーション反応液の一部でECOS™ Competent E.coli DH5αを形質転換し、生じたコロニー数を計測した。
結果
5’突出末端、3’突出末端にかかわらず、平滑化したインサートはEcoR V 断片と同じ割合でライゲーションできたことから、EcoR I 断片及びPst I 断片は37℃ 5分間の反応で十分に平滑化されていることがわかった。