Blunting-Convenience Kit

　目的の遺伝子をベクターDNAに連結する際に適当な制限酵素がない場合、DNA末端が平滑であれば配列に依存することなくライゲーションすることができます。T4 DNA Polymeraseは、DNA依存性DNAポリメラーゼで、3’→5’ Exonuclease活性と5’→3’ Polymerase活性を持ち、5’突出末端及び3’突出末端のどちらの場合もこの酵素で平滑化することができます。また、ライゲーション反応を短時間で行うことができる2×Ligation Mix ( Ligation-Convenience Kit )と組み合わせることによって、平滑化からライゲーションまでを短時間で行うことができます。

・DNA末端の平滑化からライゲーションまでを迅速、簡便に行うことが出来ます。

・10×Blunting Bufferには反応に必要なdNTPなどが含まれているので、T4 DNA Polymeraseを加えるだけで、簡単にDNA末端の平滑化が行えます。

・5’突出末端DNA, 3’突出末端DNAおよび3’末端にAが付加したPCR産物などを平滑化できます。

・2×Ligation Mixを用いて、ライゲーション反応を短時間で行うことができます。

1. T4 DNA Polymerase    25μl×1本
2. 10×Blunting Buffer    50μl×1本
3. 2×Ligation Mix          250μl×1本
   *平滑化、ライゲーション共に20μlの反応系で25回分として使用することができます。
   

1) 平滑化反応液の調製
　　5’突出末端、3’突出末端及びPCR産物など、末端を平滑化したいDNA（DNA末端濃度で0.1～10pmol)を17μlに調製する。
　　次に、10×Blunting Bufferを2μl加え混合する。

2) 酵素の添加
　　T4 DNA Polymeraseを1μl加え、ピペッティングで混合する。

3) 平滑化反応
　　37℃で5分間反応させる。

4) 反応の停止
　　平滑化反応液を氷中に置き反応を停止する。
　　すぐに使用しない場合はフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出、エタノール沈澱を行い−20℃で保存する。

5) ライゲーション反応液の調製
　　平滑化反応液、平滑末端DNAベクター溶液、を合わせて10μlのDNA溶液を調製する。
　　10μlの2×Ligation Mixを添加し、混和する。

6) ライゲーション反応
　　16℃で5～30分間反応させる。

7) 形質転換
　　反応液をそのまま形質転換に用いる。

　***第１版(2005年2月28日)***

1)　pUC19をEcoR I （5’突出末端）とPst I （3’突出末端）で切断し、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出後、TEバッファーに溶解した。
2)　EcoR I とPst I で切断したpUC19 1μgをプロトコルに従って末端を平滑化した。
3)　平滑化したDNAの一部を2×Ligation Mixを用いて16℃ 30分間ライゲーション反応を行った。
4)　ライゲーション反応後、未切断のpUC19を除きバックグラウンドをなくすため、ライゲーション反応液を5倍希釈し65℃ 5分間熱処理することでT4 DNA Ligaseを失活させた後、BamH I で切断した。
5)　BamH I で切断したライゲーション反応液でECOS™ Competent E.coli DH5αを形質転換し、生じたコロニー数を計測した。

	pUC19で形質転換したときのコロニー数を1としたときの、平滑化後セルフライゲーションによって生じたコロニー数の割合を示す。
	[結果] pUC19をEcoR I とPst I で切断したベクターを平滑化し、セルフライゲーションすると、LacZのフレームが合い青コロニーを生じる。BamH I で切断することで、pUC19由来の青コロニーは排除されているので、生じた青コロニーは末端平滑化後にセルフライゲーションでできたプラスミドである。 左記のグラフより、5分間の反応で約6割のベクターが平滑末端ライゲーションされていることがわかる。

1)　pBluescript II SK(＋)をEcoRV で切断し脱リン酸化後、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出後にTEに溶解した。
2)　λDNAを鋳型にして増幅した500bpの断片をEcoR I 及びPst I で切断し、2種類の断片を調製した。　
3)　プロトコルに従って、2種類の断片を平滑化した。
4)　pBluescript II SK(＋)をEcoRV で切断し脱リン酸化したベクターと平滑化した断片を2×Ligation Mixを用いてインサート/ベクターモル比=5で16℃ 30分間ライゲーション反応を行った。また、コントロールとしてλDNAを鋳型にして増幅した断片をEcoR V で切断した断片のライゲーション反応も行った。
5)　ライゲーション反応液の一部でECOS™ Competent E.coli DH5αを形質転換し、生じたコロニー数を計測した。

[結果]

5’突出末端、3’突出末端にかかわらず、平滑化したインサートはEcoR V 断片と同じ割合でライゲーションできたことから、EcoR I 断片及びPst I 断片は37℃ 5分間の反応で十分に平滑化されていることがわかった。

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Code No.	製品名	包装単位	希望納入価格(円)
316-06233	ECOS™ Competent E.coli DH5α	100μl×20本	36,000
313-06243	ECOS™ Competent E.coli JM109	100μl×20本	36,000
314-06251	Bac'n' Roll Beads	100回分	4,400
312-01551	T4 Polynucleotide Kinase	1,000 units	13,000
319-05961	Ligation-Convenience Kit	100回分	20,000
311-90151	Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25 : 24 : 1)	250 ml	15,000
316-90025	TE (pH8.0)	500 ml	9,000
314-90021	TE (pH8.0)	100 ml	4,000
310-90023	TE (pH8.0)	100 ml×6	15,600
318-90105	Distilled Water, Deionized, Sterile	500 ml	9,000
316-90101	Distilled Water, Deionized, Sterile	100 ml	4,000
312-90103	Distilled Water, Deionized, Sterile	100 ml×6	15,600

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