Ligation Pack

　目的の遺伝子をベクタ−DNAと連結することは、遺伝子のクロ−ニングを行う上で最初の重要なステップである。このパックにはDNAライゲ−ションに必要な試薬が全て含まれているので、プラスミドベクタ−へのサブクロ−ニング、ベクターDNAのリンカ−ライゲ−ションなど様々な実験に応じたライゲ−ション反応を組み立てることができる。さらに、このパックを用いてライゲ−ションを行った後、Transformation Kitを用いることにより高い効率でクローンを得ることが可能である。

1. 10×Ligation Buffer(1ml)
   • 500mmol/l Tris-HCl(pH7.9)
   • 100mmol/l MgCl2
   • 200mmol/l DTT
   • 10mmol/l ATP
2. 2mg/ml BSA Solution(1ml)
3. 20mmo1/l Spermidine(100µl)
4. 20mmol/l Hexamine Cobalt Chloride(HCC)(100µl)
5. H2O(1ml×2)
6. Enzyme SoIution(T4 DNA Ligase(300units/µl)100µl)

　反応の1回分は、20µlの体積でEnzyme Solutionを0.5-1µl加える系を想定している。これは通常の平滑末端ライゲ−ションが行える条件である。反応容量、加えるEnzyme Solutionの量は適宜変更することができる。また、Enzyme Solutionは、Llgation Pack専用に調製してある。

1)粘着末端ライゲ−ション

12〜16°Cで30分〜16時間反応する。高温(〜37°C)では粘着末端のアニ−リングが不十分となり、低温(〜4°C〕ではT4 DNA Ligaseの活性を低下させる結果となる。通常、粘着末端ライゲ−ションの場合スペルミジンや塩化ヘキサアンミンコバルトを入れる必要はないが、塩化ヘキサアンミンコバルトが粘着末端ライゲ−ションの効率を5倍程度促進するという報告もある1)。

2)平滑末端ライゲ−ション

粘着末端ライゲ−ションと異なりアニ−リングさせる必要はないので、16〜26°Cで反応させる。ただし粘着末端ライゲ−ションに必要な酵素量の10〜100倍が必要である。Llgation PackのEnzyme Solutionは、1µlで通常の平滑末端ライゲ−ションが行えるように調製してある。平滑末端ライゲ−ションはスペルミジンや塩化ヘキサアンミンコバルト1〕を加えると効率が促進される。これらの存在は制限酵素反応を阻害しないので、例えばリンカ−ライケ−ションの場合、ライゲ−ション反応後、T4 DNA Ligaseを熱失活させそのまま引き続いて制限酵素反応が行える。

3)その他の注意事項

(1)T4 DNA Ligaseの反応は、NaCl 150mmol/l以上の濃度で阻害されるので、DNA溶液の塩濃度が高い場合は注意が必要である。
(2)BSAは、最終濃度50〜250µg/mlが適当である。

　通常行われる条件を例としてあげた。特に効率が問題となる場合は、DNA濃度･反応温度の検討が必要である。

1)ベクタ−DNAへのサブクロ−ニング

(1)ベクタ−DNA(pUC、pBRなど)を適当な制限酵素で切断、脱りん酸化し、除タンパク質後、TEバッファ−に溶解する。
(2)クロ−ニングしたいDNA断片を精製し、TEバッファ−に溶解する。

a)粘着末端ライゲ−ションの場合 ベクタ−DNA 0.05〜0.5µg DNA断片 　 10×Ligation Buffer 2µl 2mg/ml BSA Solution 2.5µl Enzyme Solution 0.5〜1µl H2Oにて反応容量を20µlにする 16°Cで30分〜16時間反応させる

b)平滑末端ライゲ−ションの場合 ベクタ−DNA 0.05-0.5µg DNA断片 　 10×Ligation Buffer 2µl 2mg/ml BSA Solutlon 2.5µl 20mmol/l Spermidine 1µl Enzyme Solution 1〜2µl H2Oで反応容量を20µlにする 　 16°Cで30分〜16時間反応させる

2)リンカ−ライゲ−ション

この反応は、リンカ−DNAをDNA断片の平滑末端にライゲ−ションすることを目的としている。一般にリンカ−DNAはDNA断片の10〜20倍程度のモル比で加え、右のような反応系を用いる。

DNA断片 　 リンカーDNA 　 10×Ligation Buffer 2µl 2mg/ml BSA Solutlon 1µl 20mmol/l Spermidine 1µl 20mmol/l Hexamine Cobalt Chloride 1µl Enzyme Solutlon 1〜2µl H2Oて反応容量を20µlにする　 16°Cで30分〜16時間反応させる

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1)Rusche, J. R. et al. : Nucleic Acids Res., 13, 1997(1985)
2)Revie, D. et al. : Nucleic Acids Res., 16, 10301 (1988)
3)Berger, S. L. and Kimmel, A. R. : Methods in Enzymology, 152, 343(1987