RNA Synthesis Set

RNA Synthesis Setは、バクテリオファージのRNAポリメラーゼを用いてin vitroでRNA合成する際に必要な試薬をそろえたものである。特に、高比活性の一本鎖RNAプローブの調製に適している、RNA Synthesis Setには、RNAポリメラーゼの違いにより3種類の製品があり、必要に応じて使い分けることができる。反応の1回分は、20µlの容積でRNAポリメラーゼを1µl加えることを想定している。

①5×RNA Polymerase Buffer(200µl)	組成：200mmol/l Tris-HCl(pH 7.5)、30mmol/l MgCl2、10mmol/l Spermidine、1mg/ml BSA、100mmol/l DTT
②250mmol/l NaCl(100µl)*	*250mmol/l NaCl(100µl)はSP6 RNA Synthesis Setには含まれていない。
③10mmol/l rATP(50µl)
④10mmol/l rCTP(50µl)
⑤10mmol/l rGTP(50µl)
⑥10mmol/l rUTP(50µl)
⑦RNase Inhibitor(50µl, 20-40units/µl)
⑧H2O(1ml)
⑨RNA Polymerase(50µl)
⑩　Deoxyribonuclease(RT Grade) (1unit/µｌ, 50µl)

本品には、バクテリオファージRNAポリメラーゼのプロモーターが存在するベクターは含まれない。
RNAポリメラーゼの1unitは37°Cで、1時間に1nmolのリボヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む酵素活性とする。
各製品に含まれるRNAポリメラーゼの種類は次の通りである。

RNA Synthesis Set	RNA Polymerase
SP6 RNA Synthesis Set	SP6 RNA Polymerase（15 units/µl）
T3 RNA Synthesis Set	T3 RNA Polymerase（10 units/µl）
T7 RNA Synthesis Set	T7 RNA Polymerase（10 units/µl）

一本鎖RNAプローブ合成

[手順]
(1)適当なプラスミドベクターへの目的DNA断片の挿入
(2)鋳型DNAの調製
(3)RNA Synthesis Setを用いたRNA合成反応
(4)鋳型DNAの分解

[使用法](上記の(3)(4))

鋳型DNA(1µg/µl)：1µl
		5 x RNA Polymerase Buffer：4µl
		250mM NaCl：2µl (T3またはT7 RNA Polymerase使用の場合のみ添加)
		10mmol/l rATP：1µl
		10mmol/l rCTP：1µl
		10mmol/l rGTP：1µl
		[α-32P] rUTP(400-800Ci/mmol)： 8µl（T3, T7）、10µl（SP6）
		RNase Inhibitor：1µl
		RNA Polymerase：1µl
		T3またはT7 RNA Polymeraseの場合37°C、60分間 SP6 RNA Polymeraseの場合40°C、60分間
		Deoxyribonuclease(RTGrade)：1µl(1unit/µl)
	37°C、15分間
		フェノール抽出(TE飽和フェノール)
	12K x g、室温、3分間
上層
		0.1倍量3mol/l Sodium Acetate
		2.5倍量エタノール
	-80°C、30分間
	12K × g、4°C、10分間
沈殿
	70%エタノールで洗浄後、風乾
RNAプローブ

1)Bulerer, E. T. and Chamberlin, M. J. : J. Biol. Chem., 257, 5772(1982)
2)Morris, C. E., Klement, J. F. and McAllister, W. T. : Gene, 41, 193(1986)
3)Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. and Studier, F. W. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 2035(1984)