T4 Polynucleotide Kinaseは、ポリヌクレオチド5'-OH末端へ、ATPのγ位りん酸を転移する反応を触媒する酵素である。従って、DNAやRNAの5'末端の標識や合成DNAの5'末端のりん酸化に用いられる。本品は、T4ファージのpseT geneをプラスミドにクローン化して得た高産株の大腸菌より精製している。なお、りん酸化に必要な反応専用バッファー(3種類)を添付している。

製品仕様

起源	Escherichia coli JM109-(pKS-PNK7)
活性	5〜20units/µl
単位の定義	1unitは、Micrococcal nucleaseで処理した仔牛胸腺DNAを基質として、37°C、pH7.6において30分間に1nmolの[γ-32P]ATPを酸不溶性沈殿物に取り込む活性とする。
形状	50mmol/l KCl, 10mmol/l Tris-HCl(pH7.4), 0.1µmol/l ATP, 0.2mg/ml BSA, 50% Glycerol
酵素反応 条件	10×Kinase Buffer Aを用いる場合	50mmol/l Tris-HCl(pH7.6), 10mmol/l MgCl2, 5mmol/l DTT, 0.1mmol/l Spermidine, 0.1mmol/l EDTA, 37°C
	5×Kinase Buffer Bを用いる場合	50mmol/l Imidazole-HCl(pH6.4), 18mmol/l MgCl2, 5mmol/l DTT, 6%(w/v) PEG6000, 37°C
	5×Kinase Buffer Cを用いる場合	50mmol/l lmidazole-HCl(pH6.4), 18mmol/l MgCl2, 5mmol/l DTT, 0.1mmol/l Spermidine, 0.1mmol/l EDTA, 0.1mmol/l ADP, 1nmol/l ATP, 4.8%(w/v) PEG6000, 37°C
	添付の反応専用バッファー(3種類A、B、C各1ml×1本)は、酵素反応条件の10倍(A)または、5倍(B、C)の濃度である。 例えば反応容量が50µlの場合には、Aは5µl、B、Cは10µlを加える。
純度	・本酵素20unitsと1µgのλ/Hind IIIフラグメントを37°C、24時間反応させてもDNAのアガロースゲル電気泳動パターンに変化は認められない。 ・本酵素20unitsと1µgの5S rRNAを37°Cで24時間反応させてもRNAのアガロースゲル電気泳動パターンに変化は認められない。

① りん酸転移反応

　DNAやRNAの5'末端OH基にりん酸基を付加する反応の効率は、一般に、次のような順である。
(1)一本領末端＞(2)二本鎖5'突出末端＞(3)二本鎖平滑末端＞(4)二本銭3'突出末端

反応例1((1)、(2)の場合)

脱りん酸化DNA注1)	5'末端として1〜50pmol注2)
10×Kinase Buffer A(添付)	5µl
[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol、10µCi/µl注3))	50pmol(15µl)
T4 Polynucleotlde Kinase	10〜20units
	H2Oにて50µl
37°C、30分間

反応例2((3)、(4)の場合)

脱りん酸化DNA注1)	5'末端として1〜50pmol注2)
5×Kinase Buffer B(添付)	8µl
[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmo1、10µCi/µl注3))	50pmol(15µl)
T4 Polynucleotide Kinase	20units
	H2Oにて40µl
37°C、30分間

② りん酸交換反応^注4)

　この方法は、基質DNAをあらかじめ脱りん酸化しなくて良いので、便利である。

反応例

5'りん酸化DNA	5'末端として1〜50pmol注2)
5×Kinase Buffer C(添付)	10µl
[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmo1、10µCi/µl注3))	50pmol(15µl)
T4 Polynucleotide Kinase	20units
	H2Oにて50µl
37°C、30分間

注1)脱リん酸化DNAは、カラムクロマドグラフィー(Sepharose CL-4Bなど)で、低分子量の核酸を取り除いておかねはならない。また、T4 Polynucleotide Klnaseは、アンモニウムイオンで強く阻害されるので、アンモニウム塩を含む溶液中のDNAやアンモニウム塩を加えてエタノール沈殿したDNAを基質に用いてはいけない。
注2)1pmo1の5'末端とは、二本鎖DNAの場合、100塩基対が3.3×10-2µgに相当し、1,000塩基対が3.3×10-1µgに相当する。
注3)111TBq/mmol、0.37MBq/µl
注4)りん酸交換反応は、りん酸転移反応と比較してその効率が1/5〜1/10に低下する。

使用上の注意：使用例1の方法で反応効率が低い場合には2.の方法をお試し下さい。

Strain was constructed by Shoji, K.

1) Richardson, C. C. : Procedures in Nucleic Acids Res., 2, 815 ( 1971 )
2) Maniatis, T. et al. : "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, 2nd ed. 5.68(1989)