ベクター:インサートモル比の検討
ライゲーションの際のベクター : インサートの比は、ライゲーション効率に大きく影響します。以下は、TA-Blunt Ligation Kitを使用し、ニッポンジーンで様々な長さのインサートDNAをライゲーション、形質転換した結果、それぞれ下記の特定の条件で最も良い結果が得られたモル比を示した表です。
TAクローニング（TベクターへのPCR産物のライゲーション）
| インサートサイズ |
200 bp |
500 bp |
1,000 bp |
3,000 bp |
| ベクター |
1 |
1 |
1 |
1 |
| インサート |
6〜10 |
3〜6 |
1〜6 |
0.5〜1 |
- ベクターDNA : pGEM®-T Easy(Promega社) （0.025pmole）
- インサートDNA : GeneTaq NT（Code No.318-03231）で増幅したDNA(0.0125 pmole, 0.025 pmole, 0.0375 pmole, 0.15 pmole, 0.25 pmole)
- ライゲーション反応 : 16°C, 30分間
平滑末端ライゲーション
| インサートサイズ |
200 bp |
500 bp |
1,000 bp |
3,000 bp |
| ベクター |
1 |
1 |
1 |
1 |
| インサート |
6〜10 |
3〜6 |
1〜3 |
0.5〜1 |
- ベクターDNA : pBluescript®II SK(+)/EcoRV (Stratagene社) （0.025pmole）
- インサートDNA : EcoRV で切断したインサートDNA(0.0125 pmole, 0.025 pmole, 0.0375 pmole, 0.15 pmole, 0.25 pmole)
- ライゲーション反応 : 16°C, 30分間
リンカーライゲーション
リンカーライゲーション
| インサートサイズ |
8 bp |
| ベクター |
1 |
| インサート |
700〜1000 |
- ベクター : HincIIで切断したpUC19 (0.03 pmole)
- インサート : Linker EcoRV(Code No. 318-02251) (0.09 pmole, 0.3pmole, 1.5 pmole, 3 pmole, 6pmole, 15pmole, 21pmole, 30pmole)
- ライゲーション反応 : 16°C, 30分間
TA-Blunt Ligation Kit
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