ニッポンジーンの制限酵素について

1 unitは、反応混合液50 µl中、1 µgのλDNAを、60分間で完全に分解する酵素活性とする。この条件下で活性検査が困難な酵素については、その都度明記する。

1. 夾雑ヌクレアーゼ : 20 unitsの制限酵素と1 µgの基質DNAを5時間反応させて(100-fold overdigestion)アガロースゲル電気泳動を行い、短時間の酵素処理の泳動パターンと同じであることを確認している。
2. 切断-結合-再切断 : λDNAを4倍量のunitの制限酵素で2時間反応させて切断し、T4 DNA Ligaseで結合した後、再び同じ酵素で切断し、結合の前後で泳動パターンに変化がないことを確認している。
3. ニッケース : 10〜35 unitsの制限酵素と1 µgの適切なスーパーコイルDNA(例えばφX174RF I、pBR322)を5時間反応後、form II、form IIIへの転換がほとんどないことを確認している(ただし、このチェックは適したスーパーコイルDNAがある酵素についてのみ行っている)。
4. ホスファターゼ : 20〜200 unitsの制限酵素とp-nitrophenyl phosphateを、48時間反応させ、p-nitrophenolが遊離しないことを確認している。

制限酵素反応バッファーは、制限酵素1本につき1ml(1本)添付されている。

≪添付バッファー一覧表≫

添付 バッファー	ラベルの 色	組成	酵素名
10×L Buffer	黄色	100 mmol/l Tris-HCl(pH 7.9 at 25℃) 100 mmol/l MgCl2 10 mmol/l DTT	Alw44 I*, Apa I, Kpn I, Mbo II, Nar I, Nci I, Nsp V, Sac I, Sac II
10×M Buffer	水色	500 mmol/l NaCl 100 mmol/l Tris-HCl(pH 7.9 at 25℃) 100 mmol/l MgCl2 10 mmol/l DTT	Acc II, Age I, Alu I, Ava I, Ava II, Axy I, Dra I, EcoO109 I, EcoR II, EcoT38 I, Fok I, Hae II, Hae III, Hinc II, Msp I, Nhe I, Pvu II, Rsa I, Sau3A I,Sau96 I, Sfi I, Spe I, Stu I, Xba I
10×H Buffer	赤色	1000 mmol/l NaCl 500 mmol/l Tris-HCl(pH 7.9 at 25℃) 100 mmol/l MgCl2 10 mmol/l DTT	Ase I, Bcl I, Bgl I, Bgl II, BstE II, BstX I, EcoR I, EcoR V, Hinf I, Mlu I, Nco I, Nde I, Not I**, Nsi I, Pst I, Sal I, ScrF I, Sph I, Sty I, Swa I, Xho I
10×A Buffer	紫色	500 mmol/l Potassium acetate 200 mmol/l Tris-acetate(pH 7.9 at 25℃) 100 mmol/l Magnesium acetate 10 mmol/l DTT	Acc I, Afl II, Bsp1286 I, Fsp I, Sma I, Taq I
10×B Buffer	灰色	1000 mmol/l NaCl 100 mmol/l Tris-HCl(pH 8.5 at 25℃) 100 mmol/l MgCl2 10 mmol/l DTT ***	Acc III*, Acy I, BamH I, Bsm I, BssH II, Hha I, Hind III, Ssp I
10×専用 Buffer	白色	各制限酵素の酵素反応条件の10倍濃度	Bal I, Hpa I, Nde II, Nru I, Sca I

添付の反応バッファーは酵素反応条件の10倍濃度になっている。酵素反応に使用する場合には、反応容量の1/10量(反応容量50 µlの場合、5 µl)を添加する。

*Alw44 I、Acc III、およびSwa Iには1 mg/ml BSAが添付されている。酵素反応の際には、反応容量の1/10量を添加する。

**Not Iには0.1% Triton X-100が添付されている。酵素反応の際には、反応容量の1/10量を添加する。

*** 10×B bufferには毒物指定の2-Mercaptoethanolが含まれていましたが、平成20年7月より非毒物指定のジチオトレイトール (DTT)へ仕様変更いたしました。

　ニッポンジーンでは、5種類の汎用制限酵素反応バッファー(L、M、H、A、B)の中の1種類を用いて制限酵素の活性を測定している(活性測定用バッファー=添付反応バッファー、下記表中では「100」のように下線・青字・太字で示す)。この酵素活性を100%とした場合の、他の反応バッファーによる酵素活性を以下に示した。「(　)」で値が示されているものは、スター活性等の影響を受けやすい反応バッファーを示している。なお、Acc III、Alw44 Iについては、反応バッファーとは別添付のBSA溶液(1mg/ml)を最終濃度0.1 mg/mlになるよう添加して反応を行った。また、 Not Iについては、反応バッファーとは別添付の0.1% Triton X-100を最終濃度0.01%となるよう添加して反応を行った。Bal I, Hpa I, Nde II, Nru I, Sca Iについては、それぞれの専用バッファーを使用した。

制限酵素反応バッファー相対活性一覧表
制限 酵素 L M H A B 専 用 Acc I 50 75 5 100 5 - Acc II (75) 100 10 100 50 - Acc III 5 10 50 (5) 75* - Acy I 5 10 25 5 100 - Afl II 50 50 5 100 25 - Age I (75) 100 10 75 25 - Alu I 100 100 25 150 25 - Alw44 I 75* 50 5 50 25 - Apa I 100 10 5 50 5 - Ase I (10) (50) 100 (25) 100 - Ava I 10 100 10 25 50 - Ava II (75) 100 5 (75) 50 - Axy I (100) 100 50 (100) 50 - Bal I 25 10 5 25 5 100 BamH I (75) (100) 75 (75) 100 - Bcl I (100) (200) 100 (100) 200 - Bgl I (10) (50) 100 (10) 25 - Bgl II (10) (75) 100 (50) (150) - Bsm I (25) (75) 50 (75) 100 - Bsp1286 I 75 50 10 100 10 - BssH II (50) 50 75 (50) 100 - BstE II (25) (100) 100 (75) 100 - BstX I 5 75 100 25 100 - Dra I 75 100 10 50 75 -	制限 酵素 L M H A B 専 用 EcoO109 I (100) 100 10 100 50 - EcoR I - - 100 - (150) - EcoR II 5 100 75 75 100 - EcoR V (10) 75 100 25 150 - EcoT38 I 150 100 5 150 75 - Fok I (200) 100 5 (200) 100 - Fsp I 25 100 5 100 50 - Hae II 100 100 25 75 50 - Hae III 75 100 100 100 100 - Hha I (75) 75 25 (100) 100 - Hinc II 50 100 50 100 50 - Hind III (5) 75 10 (25) 100 - Hinf I 10 75 100 50 150 - Hpa I (25) (75) 25 (50) (100) 100 Kpn I 100 50 5 100 5 - Mbo II 100 75 25 75 25 - Mlu I 10 25 100 10 50 - Msp I 100 100 25 100 50 - Nar I 100 5 5 100 5 - Nci I 100 50 5 100 5 - Nco I (75) (100) 100 (100) (150) - Nde I 10 25 100 25 100 - Nde II 5 5 25 5 5 100 Nhe I (150) 100 5 (200) 10 - Not I 5 25 50* 10 50 -	制限 酵素 L M H A B 専 用 Nru I 5 5 75 5 25 100 Nsi I 75 100 100 (75) 100 - Nsp V 100 50 5 150 5 - Pst I (200) (150) 100 (150) 50 - Pvu II (50) 100 5 (50) 5 - Rsa I 200 100 5 200 50 - Sac I 100 75 10 100 10 - Sac II 100 50 5 100 5 - Sal I 5 5 100 5 5 - Sau3A I (100) 100 25 150 50 - Sau96 I 75 100 50 75 150 - Sca I (5) (25) 25 (5) (100) 100 ScrF I (75) (100) 100 (100) (150) - Sfi I 25 100 5 75 5 - Sma I 75 10 5 100 5 - Spe I (75) 100 10 (75) 75 - Sph I (100) (200) 100 (100) 100 - Ssp I (5) (75) 10 (50) 100 - Stu I 100 100 50 100 100 - Sty I (10) (75) 100 25 (75) - Swa I <5 25 75 5 75 - Taq I 25 50 25 100 100 - Xba I 50 100 25 150 25 - Xho I 10 50 100 25 150 -

注 : Acc III、Alw44 I、Swa Iについては、BSA溶液(1mg/ml)を最終濃度0.1 mg/mlになるよう添加した場合の酵素活性を100%として、各バッファーによる酵素活性を示した。また、 Not Iについては、0.1% Triton X-100を最終濃度0.01%となるよう添加した場合の酵素活性を100%として、各バッファーによる酵素活性を示した。
(例 : Acc IIIの場合、B BufferとBSA溶液を添加した場合の酵素活性を100%としている。表中のB Bufferの酵素活性の値は、B Bufferのみでの酵素活性はBSA溶液を添加した場合の75%であることを示している。)

制限酵素一覧