ISOGEN, ISOGEN-LS プロトコール(DNAの単離)

[プロトコール2　DNAの単離]

　以下の操作は、安全のために手袋を着用して行う。なお、エタノール及びくえん酸ナトリウムは別に準備しなければならない。[プロトコール2　DNAの単離]は、[プロトコール1-1　RNAの単離]でISOGEN 1mlまたはISOGEN-LS 0.75mlを用いた場合に対応する。

interphase and organic phase [protocol 1-1]*1)
↓　add 0.3ml of ethanol
↓　mix by inversion
↓　store for 2-3min. at room temperature
↓　2K×g for 5min. at 4°C
↓→→→→supernatant (for susequent isolation of proteins[protocol 3] )
↓
precipitate
↓　add 1ml of 0.1M sodium citrate in 10% ethanol*2) *3)
↓　store for 30min. at room temperature (with periodic mixing)*3)
↓　2K×g for 5min. at 4°C*3)
precipitate
↓　add 1ml of 0.1M sodium citrate in 10% ethanol*2) *3)
↓　store for 30min. at room temperature (with periodic mixing)*3)
↓　2K×g for 5min. at 4°C*3)
precipitate
↓　add 1ml of 0.1M sodium citrate in 10% ethanol*2) *3)
↓　store for 30min. at room temperature (with periodic mixing)*3)
↓　2K×g for 5min. at 4°C*3)
precipitate
↓　add 2ml of 75% ethanol
↓　store for 30min. at room temperature (with periodic mixing)*4)
↓　2K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓　dry briefly*5)
↓　add ddH2O, TE(pH8.0) or 0.5% SDS
↓　dissolve*6)
DNA solution*7)

*1)純度の高いDNAを得るには、残存する水相を注意深く完全に除去しなければならない。中間相と有機相は4°Cで一晩保存してもよい。

*2)0.1Mくえん酸ナトリウム in エタノール調製方法
1Mくえん酸ナトリウム10ml及びエタノール10mlに、100mlになるように滅菌蒸留水を加え、混合する。(1Mくえん酸ナトリウム調製方法：くえん酸三ナトリウム二水和物29.4gを蒸留水にて溶解し、100mlにメスアップし、オートクレーブで121°C20分滅菌する。)

*3)洗浄の時間を短縮してはいけない。DNA量が200µg以上の時や、DNA以外の成分が非常に多いときは、さらに洗浄を行う。

*4)この状態で4°Cで数か月は保存できる。

*5)5-10分間真空乾燥させる。完全に乾燥させるとDNAの溶解が著しく困難になる。

*6)ピペットにて穏やかに吸出して溶解する。この段階で、特に組織よりDNAを単離した場合に、さらに不溶性のゲル様の物質が含まれていることがある。その時は、遠心分離(12K×g,10min.)により除去する。不溶性物質をさらに溶解したい場合には最終濃度8mMNaOHを加えることにより、効果が得られることがある。また、この状態で4°Cで一晩保存することができるが、長時間保存するときはTE(pH8.0)で溶解した場合はそのまま、滅菌蒸留水で溶解した場合はTris-HCl(pH8.0)を最終濃度10mM、EDTAを最終濃度1mMになるように加える。NaOHで溶解した場合はHEPESで下記の表を参考にしてpHを7-8に調製し、EDTAを最終濃度1mMになるように加える。

*7)この時に不溶沈殿物が認められる。さらに純度を高めたい場合にはフェノール/クロロホルム処理をしてもよい。ただし、この場合には収量が下がることがある。[プロトコール2]に従ってDNAを単離すると、細胞の場合は60-100kbのDNAが約70%、60-20kbのDNAが約30%、培養細胞の場合は60-100kbのDNAが約80%、60-20kbのDNAが約20%得られる。しかし、DNAの平均長は、ホモジナイゼーション中のせん断力の強さに依存するので、大きなDNA断片を得たいときにはポリトロンホモジナイザーのような強力なものを避ける。得られたDNA溶液は、水で希釈してOD260を測定して収量を計算する。1 OD260=50µgds DNA/mlである。収量の目安は、106個のヒト、ラット、マウス細胞でそれぞれ7.1µg、6.5µg、5.8µgである。得られるDNAは、RNA及びタンパク質をほとんど含まず、OD260/OD280は1.7以上である。PCRや制限酵素の基質として用いる場合、滅菌蒸留水またはTE(pH8.0)で溶解した時にはそのまま使用できるが、終濃度8mMNaOHで溶解した時はあらかじめpHをHEPES添加または透析による調整が必要である。HEPESによる調整は下記の表を参考にするとよい。この方法で得たDNAは、1µg当たり3-5unitsの制限酵素により、3-24時間でその80-90%を切断することができる。

[Code No./容量]　[特長]　[保存条件]　[使用上の注意]　[参考文献]　[製品添付マニュアル]　[ISOGEN法の原理]　[プロトコール, トラブルシューティング]　[使用例]

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