Code No.	製品名	包装単位	希望納入価格	備考
317-05641	Poly(A)+ Isolation Kit from Total RNA	20回用	28,000円	Total RNAからPoly(A)＋ RNAを抽出するためのキット
314-05651	ISOGEN Poly(A)+ Isolation Pack	20回用	50,000円	ISOGENとPoly(A)＋ Isolation Kit from Total RNAのセット
311-05661	ISOGEN-LS Poly(A)+ Isolation Pack	20回用	54,000円	ISOGEN-LSとPoly(A)＋ Isolation Kit from Total RNAのセット

＞キット内容　＞保存条件　＞使用方法　＞マニュアル　＞実験例　＞トラブルシューティング　＞関連製品

Poly(A)＋ Isolation Kit form Total RNAは、Total RNAからPoly(A)＋ RNAを抽出するためのキットです。
ISOGENやISOGEN-LSによって得られたTotal RNAからPoly(A)＋ RNAを抽出するのに最適です。
細胞や組織の種類によって異なりますが、一般的にPoly(A)＋ RNAはTotal RNA中に1～5％含まれています。 そこで、よりコピー数の少ないmRNAを解析する場合、Poly(A)＋ RNAを濃縮する必要が出てきます。本キットでは、Poly(A)＋ RNAと反応性の高いOligotexTM-dT30 <Super> を用いることによってPoly(A)＋ RNAを効率よくキャッチし、その後スピンカラムを用いて迅速に洗浄・溶出操作を行うことによって、効率よく短時間で高純度のPoly(A)＋ RNAを得ることができます。
また、本キットにはEthachinmateも添付されており、得られたPoly(A)＋ RNAの濃縮が必要な際には大変便利です。

ISOGEN Poly(A)＋ Isolation Packは、ISOGENまたはISOGEN-LSとPoly(A)＋ Isolation Kit from Total RNA をセットにしたパッケージです。

Poly(A)+ Isolation Kit from Total RNA 品名 数量 Oligotex™-dT30＜Super＞ 300µl 2×Binding buffer 5 ml Wash buffer 20 ml DEPC treated Water 10 ml スピンカラムセット 20 セット スピンカラム用遠心チューブ 40個 Ethachinmate 60µl 3M Sodium Acetate 300µl

ISOGEN Poly(A)+ Isolation Pack 品名 数量 ISOGEN　 　≪医薬用外劇物≫ 100ml×1本 Poly(A)＋ Isolation Kit from Total RNA 1キット ISOGEN-LS Poly(A)+ Isolation Pack 品名 数量 ISOGEN-LS　≪医薬用外劇物≫ 100ml×1本 Poly(A)＋ Isolation Kit from Total RNA 1キット

2〜8°Cで保存して下さい。
輸送は室温で行いますが、Solution Setは到着次第4°Cに保存して下さい。

注意 : Oligotex™-dT30＜Super＞は絶対に凍結させないでください。

1.Total RNAの抽出

　Total RNAはISOGENまたはISOGEN-LSでの調製をお勧めします。Total RNAの調製はISOGENまたはISOGEN-LSに付属のマニュアルを参照して下さい。

• ISOGEN/ISOGEN-LSを用いたRNAの抽出
• ISOGEN/ISOGEN-LSを用いた微量試料からのRNAの抽出
• ISOGEN/ISOGEN-LSを用いたRNAの抽出

2.Total RNA溶液の調製

　Total RNA溶液は、以下の容量になるようにDEPC処理水を用いて調製して下さい。(この時使用するチューブは、本キット以外に別途準備して下さい。)

Total RNA量	DEPC処理水の量
250µg以下	200µl

3.Poly(A)+ Isolation Kit from Total RNA使用前の準備

Oligotex™-dT30＜Super＞を37°Cに保温して下さい。 2×Binding bufferに析出がみられる場合は、37°Cに保温し完全に溶かして下さい。 ヒートブロックを70°Cに設定して下さい。 溶出するときに使用するDEPC処理水を70°Cに保温して下さい。

4.Poly(A)+ RNAの精製

Total RNA：200 µl
　　↓←2×Binding Buffer, 200 µl
　　↓←Oligotex™-dT30<Super>, 10 µl(Total RNA, 100 µg以下) or 15 µl(Total RNA, 100〜250 µg)
　　↓加熱(70°C, 5分)(RNAの変性)
　　↓静置(室温, 10分)(Oligotex™-dT30<Super>とPoly(A)+ RNAとのハイブリダイゼーション)
　　↓遠心分離(12,000rpm, 5分)
沈殿(注1)
　　↓←Wash buffer, 350 µl
　　↓懸濁(注2)してスピンカラムに移す
　　↓遠心分離(12,000rpm, 1分)
沈殿(フィルターカップにOligotex™-dT30<Super>-Poly(A)+ RNA複合体が残る)
　　↓フィルターカップをキット付属の新しいチューブに入れる
　　↓←Wash buffer, 350 µl
　　↓懸濁(注2)
　　↓遠心分離(12,000rpm, 1分)
沈殿(フィルターカップにOligotex™-dT30<Super>-Poly(A)+ RNA複合体が残る)
　　↓フィルターカップをキット付属の新しいチューブに入れる
　　↓溶出(DEPC処理水(70°Cで保温しておいたもの)に懸濁し遠心分離(12,000rpm, 1分))(2〜3回)
Poly(A)+ RNA

• 注1：Poly(A)+ RNAが得られるまで、この時点での上清を保存しておくとよい。
• 注2：Oligotex™-dT30＜Super＞の固まりが完全に無くなるまで、完全に懸濁する。
• 注3：溶出を繰り返し行うことで、Poly(A)+ RNAの回収量は多くなるが、濃度は薄くなる。この時、使用目的に応じて付属のEthachinmateを用いてエタノール沈澱を行い、Poly(A)+ RNAを効率よく濃縮することができる。Ethachinmateを用いることで、-80°Cでのインキュベートが不要になり、沈澱を目で確認できる。また、エタノール沈殿でのPoly(A)+ RNAの回収率を上げることができる。

マニュアル一覧のページへ

　マウスの脳よりISOGENを用いてTotal RNAを抽出し、Poly(A)+Isolation Kit from Total RNAを用いてPoly(A)+ RNAを精製、濃縮した。得られたPoly(A)+ RNAについて、以下の方法でUtrophin遺伝子(約11kb)の検出を行った。

(1)RT-PCR
RT-PCR によって、Utrophin遺伝子(約11kb)の 5'末端側(1153 base)を増幅した。その結果、目的とするサイズの増幅産物を得られた。	<Lane 1> Marker(OneSTEP Ladder 100) <Lane 2> RT-PCR増幅産物
(2)ノーザンハイブリダイゼーション
Utrophin遺伝子の 5'末端側に特異的なRNAプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行ったところ、所定のバンド位置にUtrophin遺伝子が検出された。	<Lane 1> Total RNA 1µg <Lane 2> Poly(A)+ RNA 1µg
(3)Poly(A)+ RNAの回収(エタノール沈殿の際のEthachinmateの効果)
Total RNA 150 µg(ISOGENで抽出)を用いて、Poly(A)+ RNAを精製した。エタノール沈殿により濃縮し、得られたPoly(A)+ RNAの収量を260 nmの吸光度を用いて測定した。	試料 Total RNA量 回収したPoly(A)+ RNA量 Ethachinmate 有 Ethachinmate 無 Mouse Brain 150 µg 6.6 µg 5.3 µg Mouse Kidney 150 µg 6.1 µg 4.7 µg Mouse Liver 150 µg 5.9 µg 4.7 µg Mouse Testis 150 µg 5.4 µg 5.2 µg Mouse Thymus 150 µg 5.4 µg 4.4 µg

 

1.Total RNAの抽出
　
ISOGEN及びISOGEN-LSのトラブルシューティングページをご覧下さい。
ISOGEN, ISOGEN-LS トラブルシューティング(RNAの単離)

2.Poly(A)+ RNAの精製

現象	考えられる原因	対策
カラムが詰まる	Total RNAの量が多すぎる	使用するTotal RNAは250µgまでにする
	Total RNAに夾雑物が多量に含まれている	Total RNAの精製にはISOGENまたはISOGEN-LSを使用する
Poly(A)+RNAの回収率が悪い	溶出の時の液量が少なすぎる	溶出の液量を増やすか、回数を増やす
	溶出のときに使用するDEPC水の温度が低い	DEPC水を70°Cに温めておき、遠心前にOligotex-dT30を完全に懸濁する
	エタノール沈澱の時にロスをした	Ethachinmateを使用してエタノール沈殿を行う
Poly(A)+RNAが分解している	RNaseが混入した	使用する器具はRNA専用のものを使用する
rRNAの混入	洗浄操作が不十分	洗浄の際、Oligotex™-dT30の懸濁を完全に行う

品名	Code No.	包装単位	希望納入価格
ISOGEN	317-02503	50 ml	19,000円
	311-02501	100 ml	28,000円
ISOGEN-LS	311-02621	100 ml	32,000円
Ethachinmate	312-01791	0.2 ml	15,000円
DEPC treated Water	314-90205	500 ml	9,000円
Deoxyribonuclease(RT Grade)	313-03161	1,000 units	11,000円
SP6 RNA Synthesis Set	313-02441	50回分	50,000円
T3 RNA Synthesis Set	310-02451	50回分	45,000円
T7 RNA Synthesis Set	317-02461	50回分	40,000円