Ligation-Convenience Kit　

　本品は、DNAのライゲーションを迅速・簡便に行うためのキットです。
　2×Ligation Mixには、DNAのライゲーションに必要な反応バッファー、ATP、DTT、T4 DNA Ligaseなどが全て含まれており、DNA溶液と等量の2×Ligation Mixを加えるだけでDNAライゲーション反応を行うことができます。
　このキットを使用することで、DNAの末端形状に関わらず5〜30分でライゲーション反応を行うことができます。また、ライゲーション反応が終了したDNA溶液は、そのまま形質転換やin vitroパッケージングに用いることができます。

Convenience!

*DNA末端形状の違いによる条件検討が不要 条件検討はインサート/ベクターモル比調節のみです。 *実験操作が簡単な1液タイプ DNA溶液と2×Ligation Mixを混ぜるだけで使用できます。 *短時間で高効率なLigation反応 反応時間は5分間(16°C)で充分です(実験例参照)。 *反応終了液をそのまま形質転換に使用可能 形質転換効率の高い反応液組成ですので、フェノール/クロロホルム処理等は必要ありません。 *低コスト 1反応あたり200円と低コストです。

*2×Ligation Mix 250µl×4本　(20µlの反応系で、約100回分として使用することができます)
*保存 : -20°C
*融解方法 : 使用時は氷上にて完全に融解させ、ピペッティングでよく混ぜてから使用して下さい。
*備考 : 50回までの凍結融解による反応効率の低下は認められておりません。

製品マニュアルをご覧になる際にはAdobe Acrobat® ReaderまたはAdobe Acrobat® Reader Plug-inが必要です。

　第四版(2005年12月26日)

ベクターDNA Total 10 µ DNA断片 ddH2O 2×Ligation Mix 10 µl Total 20 µl

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5分間反応後そのまま形質転換 (in vitro Packagingも可能)

平滑末端ライゲーションでの性能比較

　一般的にLigation効率が悪いとされる平滑末端Ligation反応での白コロニー率(Ligation効率)、コロニー数(Ligation効率および形質転換効率)について、Ligation-Convenience KitおよびA社製品、B社製品の比較を行いました。

＜方法＞	pBluescript II SK(+)をEcoR Vで切断し、脱リン酸化、除タンパク後にTEバッファーに溶解した。 λDNA由来のDNA断片500 bpをEcoR Vで切断した。 pBluescript II SK(+) 50 ngとインサートDNA断片20 ng(インサート／ベクターモル比＝1 : 2.4)を含むDNA溶液10 µlを調製した。 DNA溶液10 µlに2×Ligation Mixを10 µl添加し、混和後、16°Cで5〜60分間反応させた。反応後、JM109コンピテントセル50 µlを反応液5 µlで形質転換し、生じたコロニー数を計測した。また、比較したキットについてはそれぞれのキットのプロトコルに従って反応を行った。
＜結果＞	Ligation-Convenience Kitでは、一般的にLigation効率が悪いとされる平滑末端でのLigation反応でも、白コロニー率(Ligation効率)、コロニー数(Ligation効率および形質転換効率)ともに良好な結果が得られた。また、反応時間は5分間で十分であった。

実験のポイント

・効率的なLigationを行うためには適切なインサート : ベクターモル比で実験を行うことが重要となります。下記ページにニッポンジーン社内にて検討を行った結果を掲載しておりますのでご参考下さい。
>>>Ligation-Convenience Kit参考資料「ベクター:インサートモル比の検討」

・効率的なLigationを行うために、下記の「Ligation-Convenience Kit Q&A」をご参考下さい。
>>>Ligation-Convenience Kit Q&A

• 16時間、オーバーナイト等の長時間のライゲーションを行うと形質転換効率が著しく低下する場合があります。
• 高塩濃度のバッファーにDNAを溶解させると、ライゲーション効率が著しく低下します。H2OまたはTE buffer (pH8.0)にて調製して下さい。
• 形質転換に用いる反応液の量はコンピテントセルの1/10量以下にして下さい。多量の反応液を使用すると、形質転換効率が低下することがあります。
• 反応液の量がコンピテントセルの1/10量以上になってしまう場合は、ライゲーション反応後、エタノール沈殿によってDNAを回収し、そのDNAをコンピテントセルの1/10量以下になるようにddH2OまたはTE buffer(pH8.0)に溶解してから形質転換を行って下さい。
• ライゲーション反応に用いるDNAの精製度、使用する制限酵素の違いによってライゲーション効率が異なる場合があります。
• パッケージングに用いる反応液の量はパッケージングExtractの1/10量以下にして下さい。多量の反応液を使用すると、パッケージング効率が低下する場合があります。
• 反応液の量がパッケージングExtractの1/10量以上になってしまう場合は、ライゲーション反応後、エタノール沈殿によってDNAを回収し、そのDNAをパッケージングExtractの1/10量以下になるようにddH2OまたはTE buffer(pH8.0)に溶解してから形質転換を行って下さい。
• ライゲーション反応終了液を熱処理すると形質転換効率が著しく低下します。熱処理を行う場合は、ライゲーション反応終了液をddH2O(DNase free)で2倍希釈してから熱処理(70°C, 10分間)を行って下さい。
• ライゲーション反応終了液にEthachinmate（共沈剤）を添加してエタノール沈殿を行うと、形質転換効率が低下します。Ethachinmateが反応系に持ち込まれている場合はPCI処理後にエタノール沈殿を行って下さい。
  詳細については次のページ Ligation-Convenience Kit参考資料「 Ethachinmateの影響 」をご覧ください。

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