LAMBDA INN

　LAMBDA INNは効率よくin vitroパッケージングするためのキットで、Freeze/Thaw LysateとSonicated Extractが1本のチューブに含まれているので、操作が簡便である。パッケージング効率は5×108 pfu/µg λ DNA以上である。パッケージングに用いるDNA溶液(〜1 µg/µl)の容量は最大6µlまで可能である。

• Packaging Extract(Yellow tube) : 30 µl×3本
• Standard λ DNA(cl857Sam7)(Clear tube) : 20 µl(0.04µg/µl)×1本
• Indicator E. coli VCS257(Glycerol Stock)(Blue tube) : 10 µl×1本

（1） パッケージングの反応※1）
	①	Packaging Extract（Yellow tube）を-80℃のフリーザーから氷中に移し、速やかに溶解させる。
	②	DNA溶液（～1 μg/μl）を1～6 μl加え、穏やかに混合する。
	③	室温（約22℃）で1～2時間放置する。
	④	Phage Buffer※2）を0.5～1 ml加え、穏やかに混合する。（数日4℃に保存する場合はクロロホルムを一滴加える）
（2）宿主菌への導入
	①	宿主菌の調製をする
		Ⅰ）	本キットに含まれているIndicator E.coliVCS257を用いてコロニーアイソレーションを行い、得られたE.coliVCS257の単一コロニーを2 mlのLB broth (20% マルトースを70 μl含む）に植菌し、37℃にて一晩振とう培養する。
		Ⅱ）	菌液1 mlを1.5 mlのチューブに取り、遠心（1500×g、5分）し、上清を残さないように取り除き、10 mM MgCl2（またはMgSO4）0.5 mlに懸濁する。
	②	パッケージング反応後のファージ液を軽く遠心（3000×g、5分）して残渣を落とし、上清の10-5希釈液※1）100 μlと、①ーⅡ）菌液100 μlを混合し、室温（約22℃）で15分間放置する。
	③	②の反応液を約50℃に保温しておいたM Top Agar※3）3 mlと速やかに混合し、すでに固化しているLB-plateに重層する。
	④	37℃で一晩培養する。プラークが形成される。
※1）	「パッケージング反応」に示したプロトコルはIn vitro Packaging Kit LAMBDA INNに含まれるλファージDNAを用いた対照実験の手順である。 組換えDNAのパッケージング効率が、λファージDNAのパッケージング効率より低下すると考えられる場合（目的のゲノムDNAがメチル化されている等）には、DNA溶液の希釈倍率を変える必要がある。
※2）	Phage Buffer （SM Buffer）　 NaCl 2.9 g MgSO4・7H2O 1 g 1 M Tris-HCl（pH7.5） 25 ml 2% Gelatin 2.5 ml 以上にH2Oを加えて500 mlの容量とし、オートクレーブ滅菌を行い、4℃で保存する。
※3）	M (LB） Top Agar Tryptone 10 g Yeast Extract 5 g NaCl 5 g Agar 7.5 g 以上にH2Oを加えて1 Lとし、オートクレーブ滅菌後、4℃で保存する。       使用時には、加熱融解させ、必要量を分取し濾過滅菌済みの1 M MgCl2を終濃度10 mMとなるように添加して用いる。 Packaging Extractを調製する際に混入する溶原化λファージDNAが、目的DNAのパッケージング反応時にパッケージングされ、プラークが形成されることはほとんどない。

　本品は、わずかながらメチル化されたDNAを制限する活性が存在するので、高度にメチル化されたゲノムDNAのパッケージングの場合に効率が低下することがある。また、エタ沈メイトで沈澱した場合も効率が低下する。

1) Maniatis, T. et al. : "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, 2nd ed., 2.3 (1989)
2) Rorsenberg, S. M. et al. : Gene., 38, 165 (1985)
3) Rorsenberg, S. M. et al. : Gene., 39, 313 (1987)

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