DNA Labelling Kit

　本品はハイブリダイゼーションに用いる高比放射能のDNAプローブを調製するキットで、30回のラベリングが行える。ランダムなヘキサヌクレオチドプライマーとKlenow Fragmentを用いたDNA合成によるプローブ調製法である。なお、放射性標識ヌクレオチドには、[3H]、[α-32P]、[α-35S]dCTPを使用する。

構成品	容量	組成・備考
DNA Labelling Buffer	300 µl	ヘキサヌクレオチドプライマー、dATP、dTTP、dGTPを含むバッファー
DNA Labelling Enzyme Solution	60 µl	1 unit/µl Klenow Fragment, 50 mmol/l りん酸カリウム (pH 7.0), 1 mmol/l DTT, 50% Glycerol
Standard DNA Solution	50 µl	2.5 µg/ml λDNA, 10 mmol/l Tris-HCl (pH 7.9)、1 mmol/l EDTA
Carrier DNA Solution	1.5 ml×2本	2.5 mg/ml Salmon Sperm DNA
BSA Solution	60 µl	10 mg/ml
H2O	1.5ml	DNA Labelling Grade

①ラベルするDNA溶液を沸騰水中にて2分間加熱後、氷冷してDNA鎖を解離する注1)。

②	DNA	25 ng〜1 µl
	DNA Labelling Buffer	10 µl
	BSA Solution	2 µl
	[α-32P]dCTP (3,000 Ci/mmol)	5 µl (50 µCi)
	H2O
	全量	48 µl

③DNA Labelling Enzyme Solutionを2 µl加えて37°Cにて3〜5時間反応させる注2)。

④反応液を沸騰水中にて2分間加熱後、氷冷し、そのままハイブリダイゼーションのプローブとして使用する注3)。

注1)	長時間の加熱や加熱の繰り返しはなるべく避ける。
注2)	純度の高いDNAであれば30分間でも80%程度の取り込みが得られる。 また、長時間(16〜20時間)の反応で取り込みは下がらない。なお、取り込み測定は下記のように行う。 ラべル反応液 1〜2 µl H2O 100 µl これより10µl取り、Carrier DNA 50 µlを加え混合した後、1 mlの5%トリクロロ酢酸(TCA)を0〜4°Cで加える。 10分間氷上に放置した後ろ過し、このろ液のカウントを液シンにて測定し、TCAのかわりにH2Oを加えて同様の操作を行ったものと比較して取り込み率を計算する。これより10µl取り、Carrier DNA 50 µlを加え混合した後、1 mlの5%トリクロロ酢酸(TCA)を0〜4°Cで加える。10分間氷上に放置した後ろ過し、このろ液のカウントを液シンにて測定し、TCAのかわりにH2Oを加えて同様の操作を行ったものと比較して取り込み率を計算する。
注3)	必要なら、ゲルろ過やエタノール沈殿を行って未反応の[α-32P]dCTPを分離する

1) Feinberg, A. P., Vogelstein, B. A. : Anal. Biochem., 132, 6(1983)
2) Feinberg, A. P., Vogelstein, B. A. : Anal. Biochem., 137, 266(1984)