Loading Dye入りの便利なプレミックスタイプPCR試薬

本品は 2×プレミックスタイプの PCR 用試薬です。PCR に必要なTaq DNA polymerase、dNTPs、MgCl2 などを含むため、鋳型 DNA とプライマーを加えるだけで PCR ができます。また予め比重と色素が含まれているため、PCR 後の反応液はそのまま電気泳動ゲルにアプライすることができます。 本品は高速 PCR にも対応できるようバッファー組成を最適化しています。比較的 GC リッチな配列や長鎖（10kbp）も増幅することができ、得られた PCR 産物は TA クローニングに使用可能と、幅広い実験に対応しています。 [備考] 本品に添加されている色素（赤色）は PCR を阻害せず、 3% Agarose 21 で電気泳動した場合は 160bp 付近、1% Agarose S で電気泳動した場合は 1.5kbp 付近に確認できます。

泳動例

• 簡単操作の 2×プレミックスタイプ
• PCR後の反応液を直接アガロースゲル電気泳動にアプライ可能
• 高速反応が可能
• -20℃保存で1年間酵素活性を保持

構成品	48回分	96回分	96回分×10	保存
Gene RED PCR Mix (2×)	1.2mL×1本	1.2mL×2本	96回分×10個	-20℃

[反応例]

Gene RED PCR Mix	25µｌ
Forward Primer（10µM）	0.6µｌ
Reverse Primer（10µM）	0.6µｌ
Template	10 pg ～ 100ng
d.d.H2O	up to 50µｌ

 ∇　 λ-DNAを鋳型とした 0.5-10 kbp フラグメントの増幅

94℃	3min.	-
94℃	20sec.	25cycles
65℃	20sec.
72℃	10sec./kbp (1kbp 未満は 5sec.)
72℃	7min.	-

 ∇

5µｌ 電気泳動

※ Primer のデザインや Template 等により反応の至適条件が変わることがあります。

実験例① インサート長 3.0kb の Colony PCR の高速化

3.0kb インサート長の plasmid を用いて DH5αを形質転換し、生じたコロニーについて各条件①～⑤でコロニー PCR インサートチェック （増幅産物 3.1kb） を行った。 PCR 終了液 5µl をそのまま 1% Agarose S にアプライし、電気泳動を行った。

反応液組成

Gene RED PCR Mix	25µｌ
Forward Primer（10µM）	0.6µｌ
Reverse Primer（10µM）	0.6µｌ
d.d.H2O	up to 50µｌ

結果： 40～50min の高速反応でも安定して 3.0kb インサートの増幅を確認できた。

Gene RED PCR Mix 実験例 「高速コロニーPCR」

実験例② 0.5～10kb 断片の増幅

λ-DNA を鋳型に本品を用いて PCR を行った。 PCR 終了液をそのまま 1% Agarose S にアプライし、電気泳動を行った。

反応液組成 Gene RED PCR Mix 25µｌ Forward Primer（10µM） 1.5µｌ Reverse Primer（10µM） 1.5µｌ λ-DNA (10pg ～ 10ng) 2µｌ d.d.H2O up to 50µｌ

反応条件 94℃ 3min - 94℃ 20sec 25cycles 65℃ 20sec 72℃ 10sec/kb 72℃ 7min - 4℃ - -

　

結果： 0.5～10kb までの断片を短時間に増幅することができた。

実験例③ GC-rich な断片の増幅

微生物由来のゲノムを鋳型に GC-rich な断片を増幅した。

反応液組成 Gene RED PCR Mix 12.5µｌ Forward Primer（10µM） 0.75µｌ Reverse Primer（10µM） 0.75µｌ d.d.H2O up to 25µｌ

反応条件 94℃ 3min - 94℃ 20sec 25cycles 60℃ 20sec 72℃ 15sec 72℃ 7min - 4℃ - -

結果： 従来品では増幅することができなかった GC-rich な配列も増幅することができた。

実験例④ マウステール抽出 DNA の PCR 増幅

マウステール 2mm （約 20mg）から各抽出方法で得られたゲノム DNA を鋳型として、PCR （増幅産物：300bp） を行った。

反応条件 94℃ 3min - 94℃ 20sec 30cycles 62℃ 20sec 72℃ 5sec 72℃ 5min - 4℃ - -

抽出方法 　・ 抽出 A ： SDS + Proteinase K + 　フェノクロ精製 　・ 抽出 B ： SDS + Proteinase K 　・ 抽出 C ： アルカリ抽出

結果： いずれの抽出方法でも、本品による標的配列の増幅が認められた。

バンドがスメアーになる

伸長時間が短いまたは長すぎることが予想されるときは、1kbp あたり 10 秒を目安に伸長反応を調節する。

エキストラバンドが出る

アニーリング温度が低いことが予想されるため、アニーリング温度を上げてみる。

増幅しない、または増幅効率が悪い

鋳型量が足りないことが予想されるため、鋳型の添加量を増やしてみる。 PCR 阻害物質の持込が予想されるため、持ち込み量を減らしてみる。
インサートの GC 含量が極端に高い場合は、変性温度を上げてみる。

Q1. 色素の影が画像解析に影響しませんか？

[A1] EtBr 染色の場合、色素が赤色のため、影になりにくく問題ありません。

Q2. 増幅が可能な鎖長はどれくらいですか？

[A2] λ-DNA を鋳型に 10kbp までの増幅を確認しています。

Q3. 増幅産物は TA クローニングに用いることは可能ですか？

[A3] Gene RED PCR Mix に含まれる DNA Polymerase はターミナルトランスフェラーゼ活性を有しているため、 PCR 産物を TA クローニングに用いることができます。

Q4. 反応液量は減らすことが出来ますか？

[A4] Colony PCR の場合は colony の pick up に爪楊枝を用いても反応液が吸収されにくい液組成になっていますので、トータル 10µl での反応が可能です。

Q5. 冷蔵ではどれくらい期間保存できますか？

[A5] 反応の安定性を1ヵ月まで確認しておりますが、3ヶ月間の冷蔵保存で約半分にまで活性が低下します。長期保存は -20℃での保存をお薦めいたします。

Q6. 凍結・融解の繰り返しはどれくらい可能ですか？

[A6] 40 回までの凍結・融解の繰り返しでは活性の低下は確認されていませんが、過度な凍結・融解の繰り返しは反応性が低下する恐れがありますので、長期保存の場合は、融解後に小分けし、 -20℃での保存をお薦めいたします。

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