Pho DNA Polymerase

耐熱性 DNA Polymerase

本品は、超好熱菌Pyrococcus horikoshii OT3 由来の耐熱性DNA Polymeraseです。
3'→5'エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を持つため、正確性の高いPCRを行なうことができます。

●活性	2.5units/µl
●分子量	80kDa
●活性定義	1unitは、activated calf thymus DNAをプライマー/鋳型として、74℃、30分間に10nmolのデオキシヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む酵素活性とする。
●純度	本酵素10unitsと1µgのpBR322 DNAとを74℃、1時間反応させてもアガロースゲル電気泳動パターンに変化は認められない。
●形状	50mM Tris-HCl(pH 8.0), 100mM NaCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 50%(v/v)Glycerol, 0.1% Triton X-100
●構成	50 units 250 units Pho DNA Polymerase (2.5units/µl) 50units×1 本 250units×1本 dNTP Mixture (2.5mM each) 160µl×2 本 800µl×2本 10×Pho Reaction Buffer(10mM Mg2+) 1ml×1 本 1ml×1本
●保存条件	-20℃（凍結不可）

本製品は、独立行政法人産業技術総合研究所の研究成果（松井郁夫ら、特許第 3015878 号）が活用されております。

●5'→3' exonuclease活性を有していない。

●強い3´→5´ exonuclease活性（Proof-reading活性）を有しているため、得られたPCR産物は平滑末端である。
　 必要に応じてリン酸化した後に、平滑末端のベクターにライゲーションできる。

●変異の頻度はPolⅠ型よりも10倍程度低く、合成の忠実度が高い。 正確な増幅が必要とされるPCR に適している。

●高次構造を取りやすいゲノムDNA、逆転写産物を鋳型にした場合にも問題なく増幅する。

●他製品と比べて、 PCR 反応の阻害物資であるSDSの影響を受けにくい。

●PCR における変性温度92℃～ 98℃で増幅量に変化はなく、熱による酵素失活は認められない。

【使用例1： λDNAを鋳型にした増幅（200bp ～ 20kbp）】

λDNAを鋳型として200～20kbpを増幅した。

Lane 1. 200bp Lane 2. 500bp Lane 3. 1kbp Lane 4. 3kbp Lane 5. 5kbp Lane 6. 8kbp Lane 7. 10kbp Lane 8. 15kbp Lane 9. 20kbp

M 1. Gene Ladder Wide 1 (0.1-20kbp) M 2. OneSTEP Marker 1(λ/Hind III digest) 0.8% Agarose S 50μl反応系のうち5μlを電気泳動

【使用例2： PCR阻害物質の存在下における増幅量の比較 】

λDNAを鋳型として3kbpを増幅した。その際にフミン酸(腐植酸）、Ethanol、SDSをそれぞれ添加し、PCR阻害物質存在下において増幅量の比較を行なった。

[各実験に共通の条件]	・Template ：λDNA 5 ng ・Primer ： 0.4µM 　 （D社 DNA polymeraseは0.3µM）	・サイクル条件 (ABI 2720) 　94℃ 2min.       94℃ 　30sec. 25cycles   55℃ 30sec. 　72℃* 3min.       72℃ 5min.   * : D社 DNA polymeraseは68℃
①Pho DNA Polymerase ②D社 DNA polymerase ③N社 DNA Polymerase

●フミン酸（腐植酸）添加

Lane 1. フミン酸 400ng Lane 2. 200ng Lane 3. 100ng Lane 4. 50ng Lane 5. 25ng Lane 6. 5ng Lane 7. なし

M 1. Gene Ladder Wide 2 ( 0.1-20kbp) 0.8% Agarose S 20μl反応系のうち5μlを電気泳動

●Ethanol 添加

Lane 1. Ethanol 10% Lane 2. 8% Lane 3. 6% Lane 4. 4% Lane 5. なし

M 1. Gene Ladder Wide 2 ( 0.1-20kbp) 0.8% Agarose S 20μl反応系のうち5μlを電気泳動

●SDS 添加

Lane 1. SDS 0.04% Lane 2. 0.02% Lane 3. 0.01% Lane 4. 0.005% Lane 5. なし

M 1. Gene Ladder Wide 2 ( 0.1-20kbp) 0.8% Agarose S 20μl反応系のうち5μlを電気泳動

【使用例3： GC-richな領域の増幅 】

HeLa細胞のゲノムDNAを鋳型としApoE遺伝子の577bp( GC含量72%）の領域を増幅した。増幅の際に Betaine（終濃度 0.5M, 1M, 1.5M, 2M）、DMSO（終濃度 2.5%, 5%, 10%）、Formamide （終濃度 2.5%, 5%, 10%）をそれぞれ反応液に添加した。

Lane 1. Betaine 0.5M Lane 2. Betaine 1.0M Lane 3. Betaine 1.5M Lane 4. Betaine 2.0M Lane 5. DMSO 2.5% Lane 6. DMSO 5.0% Lane 7. DMSO 10.0% Lane 8. Formamide 2.5% Lane 9. Formamide 5.0% Lane 10. Formamide 10.0%

M Gene Ladder 100( 0.1-2kbp) C Control (添加剤 無し) 2% Agarose S

本試験では、 Pho DNA Polymerase は Formamide 5.0% で特異的に目的の DNA 断片の増幅ができた。