Yeast total RNAとの比較
要約
同濃度のYeast total RNAとRTmateを1 Step Quantitative RT-PCRの反応液に添加し、効果を比較しました。その結果、Yeast
total RNAを添加しても大幅な向上が見られないのに対し、RTmateを添加した場合は結果が明らかに向上することが分かりました。
材料と方法
a)材料
- 鋳型 :マウス(C57BL/6、8週齢、male)の肝臓から抽出した total RNA
- 標的遺伝子 : insulin-like growth factor I (IGF-I)
- プライマーとプローブ
- IGF-1 Forward Primer : CTACAAAAGCAGCCCGCTCTA
- IGF-1 Reverse Primer : TCCTTCTGAGTCTTGGGCATGT
- IGF-1 Double-Dye Probe : FAM - CCGTGCCCAGCGCCACACT - TAMRA
- 増幅サイズ : 64 bp
- 試薬
- ISOGEN
- Reverse Transcriptase qPCR™ Core Kit + qPCR™ Core Kit
- RTmate (Lot No. 0100)
- Yeast RNA (A社 Yeast RNA 5 mg/ml, diluted into 50 ng/µl with TE)
b)方法
- RNA抽出
- ISOGENのプロトコル通り
- 鋳型の調製
-ISOGENを用いて抽出したtotal RNAを適切な濃度に水で希釈
- Quantitative RT-PCR
- Reverse Transcriptase qPCR™ Core Kit + qPCR™ Core Kitを用いてABI GeneAmp 5700上で1 Step Quantitative RT-PCRを行った
Contents of Quantitative RT-PCR mixture
| Component |
Volume(µl) |
Final conc. |
| 10 × qPCR Core Kit Buffer |
5 |
1 × |
| RNase Inhibitor(20 U/µl) |
1 |
0.4U/µl |
| 25 mM MgCl2 |
10 |
5 mM |
| 2.5 mM dNTP |
4 |
500 µM each |
| 3 µM IGF-I Primer Mixture |
5 |
300 nM |
| 2 µM IGF-I Probe |
5 |
200 nM |
| Hot Goldstar(5 U/ul) |
0.25 |
0.025 U/µl |
| EuroScript RT(50U /ul) |
0.25 |
0.25 U/µl |
| RTmate or Yeast RNA |
0, 1 or 5 |
|
| Template |
5 |
|
| H2O |
up to 50 µl |
|
|
| Total |
50 |
|
↓
PCR cycle setting
| 48°C |
30 min. |
|
| 95°C |
10 min. |
|
| 95°C |
15 sec. |
× 40 cycles |
| 60°C |
30 sec. |
| 72°C |
30 sec. |
結果
考察
Yeast total RNAを添加したサンプルの増幅効率は、コントロールサンプルの増幅効率とそれほど変わりませんでした。一方、RTmateを添加した場合は、特に鋳型の量が少ないサンプルで、大幅な結果の改善が認められました。この結果から、RTmateはYeast
total RNAよりも効果的であると言えます。
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