Yeast transfer RNA(tRNA)との比較

同濃度のYeast transfer RNAとRTmateを1 Step Quantitative RT-PCRの反応液に添加し、効果を比較しました。

a)材料

• 鋳型 :マウス(C57BL/6、8週齢、male)の肝臓から抽出した total RNA
• 標的遺伝子 : insulin-like growth factor I (IGF-I)
• プライマーとプローブ
  - IGF-1 Forward Primer : CTACAAAAGCAGCCCGCTCTA
  - IGF-1 Reverse Primer : TCCTTCTGAGTCTTGGGCATGT
  - IGF-1 Double-Dye Probe : FAM - CCGTGCCCAGCGCCACACT - TAMRA
  - 増幅サイズ : 64 bp
• 試薬
  - ISOGEN
  - Reverse Transcriptase qPCR™ Core Kit + qPCR™ Core Kit
  - RTmate (Lot No. 0100)
  - Yeast RNA (I社 Yeast tRNA 25 mg, diluted into 50 ng/µl withWater)

b)方法

• RNA抽出
  - ISOGENのプロトコル通り
• 鋳型の調製
  -ISOGENを用いて抽出したtotal RNAを適切な濃度に水で希釈
• Quantitative RT-PCR
  - Reverse Transcriptase qPCR™ Core Kit + qPCR™ Core Kitを用いてABI GeneAmp 5700上で1 Step Quantitative RT-PCRを行った

Contents of Quantitative RT-PCR mixture

Component	Volume(µl)	Final conc.
10 × qPCR Core Kit Buffer	5	1 ×
RNase Inhibitor(20 U/µl)	1	0.4U/µl
25 mM MgCl2	10	5 mM
2.5 mM dNTP	4	500 µM each
3 µM IGF-I Primer Mixture	5	300 nM
2 µM IGF-I Probe	5	200 nM
Hot Goldstar(5 U/ul)	0.25	0.025 U/µl
EuroScript RT(50U /ul)	0.25	0.25 U/µl
RTmate or Yeast tRNA	0, 1 or 5
Template	5
H2O	up to 50 µl
Total	50

↓

PCR cycle setting

48°C	30 min.
95°C	10 min.
95°C	15 sec.	× 40 cycles
60°C	30 sec.
72°C	30 sec.

Yeast tRNAを添加したサンプルの増幅効率は、コントロールサンプルの増幅効率とそ れほど変わりませんでした。一方、RTmateを添加した場合は、特に鋳型の量が少ないサンプルで、結果の改善が見られました。

• RTmate製品説明
• RTmate配列
• 実験例
  • Yeast total RNAとの比較
  • Yeast transfer RNAとの比較