1. PCR の原理

 PCR とは、Polymerase Chain Reaction の略である。文字通りDNAポリメラーゼを用いて連鎖反応的にDNAを増幅する方法である。PCR法の開発は、分子生物学のみならず、さまざまな分野に影響を与えた。
 PCRの原理は、増幅しようとするDNAとその両端の配列に相補的な一対のDNAプライマーおよび耐熱性DNAポリメラーゼを用いて、3段階の温度変化をnサイクル繰り返すことによって標的DNAを2n倍に増幅することにある。温度変化の第1段階(94〜96°C)で、標的二本鎖DNAを熱変性して一本鎖とし、第2段階(55〜60°C)でプライマーを一本鎖DNAにアニーリングさせ、第3段階(72〜74°C)で伸長反応を進める。1サイクルで標的DNAは2倍になる。従って理論的にはnサイクルの反応で標的DNAは2n倍に増幅されるので20サイクルでは約100万倍に増幅されることになる。実際には数100万倍まで増幅することができる。

PCR

 

 

 

 

 

・・・・・・図 PCRによるDNA増幅の原理

 

2. PCRに影響を与える因子

このようにPCRは非常に簡単にDNAを増幅できるわけであるが、さまざまな反応条件によって影響を受けるので、行う実験によって反応条件の最適化を行った方がよい。Taq DNAポリメラーゼを用いたPCRに影響を与える因子について以下に簡単に解説する。

1) 酵素濃度 Taq DNAポリメラーゼは、通常1〜2.5units/100µl 反応液で使用される。
一般に濃度が高すぎると非特異的産物が出現することがあり、逆に濃度が低すぎると増幅が不十分になる。
2) dNTP濃度 dNTP濃度は通常それぞれ20〜200µM である。各dNTP濃度は同一でないと誤った取り込みによるエラーが生じる原因となる。特異性と忠実度は、dNTP濃度が低いほど高くなる。理論的には、100µl 反応液で20µM の各dNTPが存在すれば2.6µgのDNAが合成できる。
3) Mg2+濃度 通常総dNTP濃度より0.5〜2.5mmol/l 高い濃度が採用される。
鋳型DNAやプライマーから持ち込まれるEDTAなどのキレート剤の濃度に注意しなければならない。
4) プライマー プライマーは、通常18〜28ヌクレオチド長で、G+C含量が50〜60%で、Tm値が55〜80°Cとなるように設計する。2つのプライマーはそれぞれ0.1〜0.5µMで使用する。変性温度は高いほど特異性や増幅度が高くなるが、逆に Taq DNAポリメラーゼの活性低下を早めるので、普通は94〜96°Cで15〜30秒間である。
5) 温度 プライマーのアニーリング温度は。Tm値より5°C程低い温度がよく、通常55〜60°Cである。アニーリング温度が高いほど特異性は高くなる。0.2µMのプライマーは数秒でアニーリングする。
伸長反応の温度は、72°Cが多く用いられる。合成速度は、他の条件にもよるが、1秒間で35〜100ヌクレオチドである。
6) サイクル数 サイクル数は多いほど増幅度は高くなるが、同時に非特異的産物が増加する。40サイクルを越えないことが望ましい。理論的には指数関数的に増幅するが、実際にはプラトーになる。プラトーになる条件は、反応条件により異なる。
7) その他 pHもPCRに影響を及ぼす。通常10〜50mmol/l Tris-HCl(pH8.3〜8.8 at 20°C)が用いられる。また、塩濃度、ゼラチンや非イオン性界面活性剤の存在によっても影響を受ける。

 

3. PCR法の実際

1) プライマーの設計

 プライマーの設計上のポイントは以下の通りである。

2) 反応系

 ニッポンジーンのGene Taq またはGene Taq NT を用いた標準的なPCRの実験例は以下の通りである。なお、プライマーのデザインや鋳型DNAなどにより反応の至適条件が変わることがある。

例1) ColE1 DNAに挿入した500 bpのフラグメントの増幅

反応液組成
鋳型DNA
<1µg
10×Gene Taq Universal Buffer(添付)
5µl
dNTP Mixture(2.5mmol/l each)(添付)
4µl
primer-forward(20pmol/µl)
1µl
primer-reverse(20pmol/µl)
1µl
Gene TaqまたはGene Taq NT(5units/µl)
0.5µl
ddH2O
up to 50µl

PCR cycle setting
94°C 30 sec. 20 cycles
55°C 30 sec.
72°C 1 min.

10µlを電気泳動

 

例2) λDNA(5kbp, 15kbp)の増幅

反応液組成
鋳型DNA
<1µg
10×Gene Taq Universal Buffer(添付)
5µl
dNTP Mixture(2.5mmol/l each)(添付)
4µl
primer-forward(20pmol/µl)
1µl
primer-reverse(20pmol/µl)
1µl
Gene TaqまたはGene Taq NT(5units/µl)
0.5µl
ddH2O
up to 50µl

PCR cycle setting
94°C 1 min.
94°C 30 sec. 30 cycles
68°C 12 min.
72°C 5 min.

10µlを電気泳動

Gene Taqは500bpと5kbpはそれなりに増えているが15kbpは増えていない。Gene Taq NTはどれも増幅しているが、500bpはGene Taqよりもやや少なく、5kbは大幅に良く、15kbpでもバンドは確認できている。
  • M : Marker 6 (λ/Sty I digest)
  • Lane 1 : Template=ColE1 DNA(500 bp)
  • Lane 2 : Template=λDNA(5 kbp)
  • Lane 3 : Template=λDNA(15 kbp)
  • M : Marker 6 (λ/Sty I digest)
0.8% Agarose S
100 V、30分

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