CUGA®7 in vitro siRNA Synthesis Kit

製品概要

　CUGA®7 in vitro siRNA Synthesis Kitは、独自に開発したCUGA®7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写反応によって、siRNA(small interfering RNA)を調製するキットです。
　本キットを使用することにより、大量のsiRNAを安価に調製することが可能です(25〜100 µg/1反応)。また、ほとんどの反応を1チューブで行うことができるため、非常に簡便な操作でsiRNAを調製することができます。

　この製品は株式会社ニッポンジーンテクで開発・製造を行い、株式会社ニッポンジーンが販売を担当しています。
株式会社ニッポンジーンテクホームページ

特長

1.化学合成したsiRNAと同等のRNAi効果

独自開発のCUGA®7 RNAポリメラーゼは、他社製品が採用している野生型T7 RNAポリメラーゼよりも転写反応が正確です。本キットで作製したsiRNAは、化学合成したsiRNAと同等のRNAi効果を発揮します。

2.操作が簡便

両鎖(センス鎖、アンチセンス鎖)の転写反応を1チューブ内で同時に行うため、操作がとても簡便です。
また、1日でsiRNAの作製が完了するので、多くのsiRNAを比較検討する必要があるスクリーニングに最適です。

3.大量に合成できコストパフォーマンスが良好

独自開発のCUGA®7 RNAポリメラーゼは、他社製品が採用している野生型T7 RNAポリメラーゼよりも転写効率が高く、大量に合成できます。
また、1反応当たりのコストも低く、多くのsiRNAを比較検討するスクリーニングに最適です。

原理

Step 1. ターゲット遺伝子に対するsiRNAの配列(21塩基)とT7プロモーターの相補鎖の配列(18塩基)をつないだセンス鎖、アンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成します。

標的配列と鋳型オリゴの位置関係

鋳型オリゴヌクレオチドの配列

Step 2. これら2本の鋳型オリゴヌクレオチドと、キットに含まれているT7プロモーターオリゴヌクレオチド(5'-TAATACGACTCACTATAG-3')をアニーリングします。

鋳型オリゴヌクレオチドとT7プロモーターオリゴヌクレオチドのアニーリング

Step 3. こうしてできた二本鎖DNAを鋳型にしてCUGA®7 RNAポリメラーゼによりセンス、アンチセンスのRNAを合成します。合成されたRNAは二本鎖を形成します。

CUGA®7 RNAポリメラーゼによる合成

Step 4. 二本鎖RNAをヌクレアーゼ処理し、鋳型オリゴDNA、一本鎖RNA等を分解します。

ヌクレアーゼ処理

Step 5. 精製後、3'末端が2塩基突出したsiRNAとなります。

siRNA


RNAi実験

鋳型オリゴヌクレオチドの設計方法

鋳型オリゴDNAは、下記の手順で設計できます。

1. 標的遺伝子のmRNA塩基配列から、siRNA作製に適した23塩基を選択します。
   (候補配列の2番目と22番目(=両端より2番目)の塩基はAまたはTである必要があります)
2. さらに、1.で選択した23塩基のうちの5'側21塩基を選択します。
3. 2.で選択した21塩基の3'側に、T7 promoter DNA oligonucleotideの相補鎖(5'-CTATAGTGAGTCGTATTA-3')を追加します。
   これをSense RNA template oligonucleotideの塩基配列とします。
4. 1.で選択した23塩基のうちの3'側21塩基を選択します。
5. 4.で選択した21塩基の配列の相補鎖を作製します。
6. 5.で作製した相補鎖の3'側に、T7 promoter DNA oligonucleotideの相補鎖を追加します。
   これをAntisense RNA template oligonucleotideの塩基配列とします。

実験データ1 [化学合成および野生型T7 RNAポリメラーゼによるsiRNAとの比較]

　5×104個のHeLa細胞に対して、pGL3-Control(1µg)、 pRL-TK(0.1µg)と、"Control siRNA duplex, Firefly Luciferase GL3"、CUGA®7 RNA ポリメラーゼ、または野生型T7 RNA ポリメラーゼで合成したsiRNA(終濃度10nM、0.1nM)をリポフェクション法を用いて同時導入し、24時間後にルシフェラーゼ活性を測定してRNAi効果を確認した。

ページトップに戻る

実験データ2 [化学合成siRNAとの比較(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)]

　CUGA®7 in vitro siRNA Systhesis Kitで合成したsiRNA、および化学合成したsiRNAを、未変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。

左 : CUGA®7 in vitro siRNA Synthesis Kit 右 : 化学合成siRNA* *化学合成siRNAの末端突出部位がdTdTであるため泳動度が異なる

実験データ3 [化学合成siRNAとの比較 (Human cdk1)]

　1×106個のHeLa細胞に対して、CUGA®7 in vitro siRNA Synthesis Kitで合成したsiRNAおよび化学合成siRNA "Control siRNA duplex, Human cdk1"(終濃度1µM)をエレクトロポレーション法を用いて導入した。24時間後に細胞を回収し、タンパク定量、SDS-PAGE、Western Blottingを行い、cdk1およびGAPDH(Control)の発現量を比較した。

Negative Control (No transfection) CUGA®7 in vitro siRNA Systhesis Kit 化学合成siRNA 化学合成siRNA (Luciferase GL3)

実験データ4 [化学合成siRNAとの比較 (Firefly Luciferase GL3)]

　5×104個のHeLa細胞に対して、pGL3-Control(1µg)、 pRL-TK(0.1µg)と、"Control siRNA duplex, Firefly Luciferase GL3"またはCUGA®7 in vitro siRNA Systhesis Kitで合成したsiRNA(終濃度10nM、1nM、0.1nM)をリポフェクション法を用いて同時導入し、24時間後にルシフェラーゼ活性を測定してRNAi効果を確認した。

ページトップに戻る

実験データ5 [GFP遺伝子のRNAi実験 (Jellyfish GFP)]

　5×104個のHeLa細胞に対して、pEGFP-N1(1µg)と、CUGA®7 in vitro siRNA Synthesis Kitで合成したsiRNA(終濃度1nM)をリポフェクション法を用いて同時導入し、2日後にGFPの発現を観察した。

siRNA : 1nM	Negative Control (H2O)

キット内容

　本製品には下記の試薬およびマニュアルが含まれています。

	5反応用キット	20反応用キット
CUGA®7 Enzyme Solution	10 µl×1本	40 µl×1本
5×Transcription Reaction Buffer	40 µl×1本	160 µl×1本
NTP Mixture	60 µl×1本	240 µl×1本
2×Annealing Buffer	40 µl×1本	160 µl×1本
T7 Promoter DNA Oligonucleotide	20 µl×1本	80 µl×1本
DNase Enzyme Solution	20 µl×1本	80 µl×1本
RNase Enzyme Solution	10 µl×1本	40 µl×1本
Digestion Reaction Buffer	40 µl×1本	160 µl×1本
Enzyme Dilution Buffer	10 µl×1本	40 µl×1本
0.1M DTT	20 µl×1本	80 µl×1本
10M Ammounium Acetate	250µl×1本	1mL×1本
Control GL3 siRNA Template	8 µl×1本	16 µl×1本
H2O (RNase-free)	1 ml×2本	5 ml×1本
マニュアル	1部	1部

関連製品

Control siRNA duplex

Code No.	品名	容量	希望納入価格
319-05841	Control siRNA duplex, Human β-actin	5 nmol	20,000円
316-05851	Control siRNA duplex, Human NuMA	5 nmol	20,000円
313-05861	Control siRNA duplex, Human cdk1	5 nmol	20,000円
310-05871	Control siRNA duplex, Human Eg-5	5 nmol	20,000円
317-05881	Control siRNA duplex, Human Lamin A/C	5 nmol	20,000円
314-05891	Control siRNA duplex, Human Lamin B1	5 nmol	20,000円
317-05901	Control siRNA duplex, Human Vimentin	5 nmol	20,000円
314-05911	Control siRNA duplex, Jellyfish GFP	5 nmol	20,000円
311-05921	Control siRNA duplex, Firefly Luciferase GL2	5 nmol	20,000円
318-05931	Control siRNA duplex, Firefly Luciferase GL3	5 nmol	20,000円

[Product List]
[Back To Top Page]