ALDH2の遺伝子型決定

ISOHAIR実験例
アルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子の遺伝子型決定

3検体のヒトの毛髪からDNAを抽出し、正常型特異的増幅と変異型特異的増幅を行い、アルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子の遺伝子型を決定しました。

アルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子について

アルデヒドデヒドロゲナーゼ2(ALDH2)は、飲酒後エタノールが代謝されてできるアルデヒドを酸化して代謝する酵素です。ALDH2の欠損はALDH2遺伝子の点突然変異によるものと考えられており、対立遺伝子の組み合わせから、正常型ホモ接合体(NN型)、ヘテロ接合体(MN型)、変異型ホモ接合体(MM型)の3種類の遺伝子型が知られています。3種類のうちのどの遺伝子型を持っているかを調べることで、酒に強いか弱いかを判断することができます。正常型ホモ接合体は酒が飲めるタイプ、ヘテロ接合体は飲む事はできるがすぐ顔に出るタイプ、変異型ホモ接合体は全く飲めないタイプです。ALDH2欠損者においては、飲酒後、血中アセトアルデヒド濃度の上昇により、フラッシング反応(顔面紅潮、動悸、悪心、低血圧等)が見られます。

Material and Method

鋳型
ISOHAIRを用いてヒト毛髪より抽出したDNA

プライマー配列

Forward : 5'-CAAATTACAGGGTCAACTGCT-3'

Reverse-N(野生型) : 5'-CCACACTCACAGTTTTCTCTTC-3'

Reverse-M(変異型) : 5'-CCACACTCACAGTTTTCTCTTT-3'

PCR用試薬

Gene Taq NT

10×Gene Taq Universal Buffer

dNTP Mixture(2.5mM each)

d.d.H2O

PCR反応液

鋳型 1µl

10×Gene Taq Universal Buffer 5µl

dNTP 4µl

プライマー(Forward, 20pmol/µl) 1µl

プライマー(Reverse-NまたはM, 20pmol/µl) 1µl

d.d.H2O 37.75µl

Gene Taq NT 0.25µl

Total 50µl

PCRサイクル条件

98℃ 1分 -

98℃ 20秒 35サイクル

60℃ 20秒

72℃ 45秒

72℃ 5分 -

Result

PCR産物の電気泳動

Lane1 : Marker 5(φX174/Hinc II digest)

Lane2 : Sample1/Reverse-N(野生型)

Lane3 : Sample1/Reverse-M(変異型)

Lane4 : Sample2/Reverse-N(野生型)

Lane5 : Sample2/Reverse-M(変異型)

Lane6 : Sample3/Reverse-N(野生型)

Lane7 : Sample3/Reverse-M(変異型)

Agarose 21 3% gelで泳動

Sample1ではReverse-Nのみ、Sample2ではReverse-N、Mの両方、Sample3ではReverse-Mのみバンドが確認できました。この結果から、Sample1がNN型(野生型ホモ)、Sample2がMN型(ヘテロ)、Sample3がMM型(変異型ホモ)であることが分かりました。

補足情報：プライマー配列について

　上記実験例で紹介しているプライマー配列の設計は、下記論文を参考にしました。

"Characterization of the three genotypes of low Km aldehyde dehydrogenase in a Japanese population."
T. Takeshita et al. Hum Genet (1994) 94:217-223

　この論文ではPCRにより人工的な制限酵素サイトを導入しています。つまりReverseプライマーのTTCAC部位をTTCTCに変えて、そのPCR産物を制限酵素で処理することによりALDH2の遺伝子型を決定しています。
　そのため、このReverseプライマー配列と、それに対応するALDH2のゲノム配列を比較すると、一塩基相補的でない部位があることが分かります（下記Tの部分）。

ALDH2ゲノム
5'-GAA GTG AAA ACT GTG AGT GTG G-3'

Reverse プライマー (野生型)
3'-CTT CTC TTT TGA CAC TCA CAC C-5'

　弊社では、制限酵素処理をせずにPCRのみで遺伝子型を決定するために、まず標的部位が確実に増えている上記論文のプライマー配列を参考にしました。そのため、上記論文で制限酵素サイトを導入するために入れたミスマッチ部位はそのまま残してあります。

補足情報 : 増幅領域について

　上記のプライマーはALDH2のexon 12の全体を増幅します。NCBIのAccession No.はM20455です。なおALDH2全体についてはAH002599で情報を取得できます。
　下記は2004.07.22現在のexon 12の情報です。最新の情報はNCBIのデータベースでご確認ください。塩基配列中のプライマー部位は下線で示してあります。

LOCUS       HUMALDH12                135 bp    DNA     linear   PRI 31-OCT-1994
DEFINITION  Human nucleus-encoded mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2
            (ALDH2) gene, exon 12.
ACCESSION   M20455 J03043
VERSION     M20455.1  GI:178387
KEYWORDS    aldehyde dehydrogenase; aldehyde:NAD+ oxidoreductase;
            nuclear-encoded mitochondrial EF-G-like protein.
            SEGMENT     12 of 13
SOURCE      Homo sapiens (human)
  ORGANISM  Homo sapiens
            Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
            Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
REFERENCE   1  (bases 1 to 135)
  AUTHORS   Hsu,L.C., Bendel,R.E. and Yoshida,A.
  TITLE     Genomic structure of the human mitochondrial aldehyde dehydrogenase
            gene
  JOURNAL   Genomics 2 (1), 57-65 (1988)
  MEDLINE   88256152
   PUBMED   2838413
REFERENCE   2  (sites)
  AUTHORS   Crabb,D.W., Edenberg,H.J., Bosron,W.F. and Li,T.K.
  TITLE     Genotypes for aldehyde dehydrogenase deficiency and alcohol
            sensitivity. The inactive ALDH2(2) allele is dominant
  JOURNAL   J. Clin. Invest. 83 (1), 314-316 (1989)
  MEDLINE   89093436
   PUBMED   2562960
COMMENT     Original source text: Human DNA (library of Y.-F.C.Lau), clones
            pCV[105,108], and cDNA to mRNA, clones
            ALDH2[105-1,105-2,105-20,108-12a].
            [2]  sites; allele ALDH2-2 variation.
            Draft entry and printed copy of sequence for [1] kindly provided by
            L.C.Hsu, 01-MAR-1988.
            Many orientals lack the mitochondrial aldehyde dehydrogenase
            (ALDH2) activity responsible for the oxidation of acetaldehyde
            produced during ethanol metabolism.  A substitution of lysine for
            glutamate at amino acid position 487 produced by a point mutation
            at position 114 (g->a) in the sequence below is the cause.
FEATURES             Location/Qualifiers
     source          1..135
                     /organism="Homo sapiens"
                     /mol_type="genomic DNA"
                     /db_xref="taxon:9606"
                     /map="12q24.2"
     gene            join(M20444.1:162..721,M20445.1:1..125,M20446.1:1..162,
                     M20447.1:1..100,M20448.1:1..132,M20449.1:1..149,
                     M20450.1:1..134,M20451.1:1..123,M20452.1:1..204,
                     M20453.1:1..186,M20454.1:1..178,1..135,M20456.1:1..43)
                     /gene="ALDH2"
     CDS             join(M20444.1:601..714,M20445.1:11..115,M20446.1:11..151,
                     M20447.1:11..90,M20448.1:11..122,M20449.1:11..139,
                     M20450.1:11..124,M20451.1:11..113,M20452.1:11..194,
                     M20453.1:11..176,M20454.1:11..168,11..125,M20456.1:11..43)
                     /gene="ALDH2"
                     /EC_number="1.2.1.3"
                     /note="precursor"
                     /codon_start=1
                     /product="aldehyde dehydrogenase"
                     /protein_id="AAA51693.1"
                     /db_xref="GI:178390"
                     /db_xref="GDB:G00-119-668"
                     /translation="MLRAAARFGPRLGRRLLSAAATQAVPAPNQQPEVFCNQIFINNE
                     WHDAVSRKTFPTVNPSTGEVICQVAEGDKEDVDKAVKAARAAFQLGSPWRRMDASHRG
                     RLLNRLADLIERDRTYLAALETLDNGKPYVISYLVDLDMVLKCLRYYAGWADKYHGKT
                     IPIDGDFFSYTRHEPVGVCGQIIPWNFPLLMQAWKLGPALATGNVVVMKVAEQTPLTA
                     LYVANLIKEAGFPPGVVNIVPGFGPTAGAAIASHEDVDKVAFTGSTEIGRVIQVAAGS
                     SNLKRVTLELGGKSPNIIMSDADMDWAVEQAHFALFFNQGQCCCAGSRTFVQEDIYDE
                     FVERSVARAKSRVVGNPFDSKTEQGPQVDETQFKKILGYINTGKQQGAKLLCGGGIAA
                     DRGYFIQPTVFGDVQDGMTIAKEEIFGPVMQILKFKTIEEVVGRANNSTYGLAAAVFT
                     KDLDKANYLSQALQAGTVWVNCYDVFGAQSPFGGYKMSGSGRELGEYGLQAYTEVKTV
                     TVKVPQKNS"
     intron          <1..10
                     /gene="ALDH2"
                     /note="G00-119-668"
                     /number=11
     exon            11..125
                     /gene="ALDH2"
                     /note="G00-119-668"
                     /number=12
     variation       114
                     /gene="ALDH2"
                     /note="g in ALDH2-1 allele; a in ALDH2-2 allele"
     intron          126..>135
                     /gene="ALDH2"
                     /note="G00-119-668"
                     /number=12
ORIGIN      3.7 kb after segment 11; chromosome 12q24.2.
        1 caaattacag ggtcaactgc tatgatgtgt ttggagccca gtcacccttt ggtggctaca
       61 agatgtcggg gagtggccgg gagttgggcg agtacgggct gcaggcatac actgaagtga
      121 aaactgtgag tgtgg
//

補足情報：ALDH2遺伝子について

ALDH2遺伝子は第12染色体長腕 (12q24.2) に位置し、44kbの塩基配列中に517個のアミノ酸をコードする少なくとも13個のエクソンを有しています。プロセシングを受けてシグナルペプチドが取り除かれるため、ALDH2の成熟タンパク質は500個のアミノ酸からなります。
ALDH2活性の欠損は主にALDH2遺伝子の点突然変異によるもので、ALDH2遺伝子の第12エクソンの114番目の塩基がG（グアニン）からA（アデニン）へ変異をおこしており、その結果、成熟タンパク質中の第487番目のアミノ酸がグルタミン酸（GAA）からリジン（AAA）に置換されています。

ISOHAIR
ISOHAIR Jr.
Gene Taq NT
Agarose 21
Marker 5
50×TAE
EtBr Solution

カスタムオリゴ合成(NIPPON EGT)

ALDH2ゲノム	5'-GAA GTG AAA ACT GTG AGT GTG G-3'
Reverse プライマー (野生型)	3'-CTT CTC TTT TGA CAC TCA CAC C-5'

ISOHAIR実験例 アルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子の遺伝子型決定

ISOHAIR実験例
アルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子の遺伝子型決定