- Lane1 : Marker 5(φX174/Hinc II digest)
- Lane2 : Sample1/Reverse-N(野生型)
- Lane3 : Sample1/Reverse-M(変異型)
- Lane4 : Sample2/Reverse-N(野生型)
- Lane5 : Sample2/Reverse-M(変異型)
- Lane6 : Sample3/Reverse-N(野生型)
- Lane7 : Sample3/Reverse-M(変異型)
Agarose 21 3% gelで泳動
3検体のヒトの毛髪からDNAを抽出し、正常型特異的増幅と変異型特異的増幅を行い、アルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子の遺伝子型を決定しました。
| アルデヒドデヒドロゲナーゼ2(ALDH2)は、飲酒後エタノールが代謝されてできるアルデヒドを酸化して代謝する酵素です。ALDH2の欠損はALDH2遺伝子の点突然変異によるものと考えられており、対立遺伝子の組み合わせから、正常型ホモ接合体(NN型)、ヘテロ接合体(MN型)、変異型ホモ接合体(MM型)の3種類の遺伝子型が知られています。3種類のうちのどの遺伝子型を持っているかを調べることで、酒に強いか弱いかを判断することができます。正常型ホモ接合体は酒が飲めるタイプ、ヘテロ接合体は飲む事はできるがすぐ顔に出るタイプ、変異型ホモ接合体は全く飲めないタイプです。ALDH2欠損者においては、飲酒後、血中アセトアルデヒド濃度の上昇により、フラッシング反応(顔面紅潮、動悸、悪心、低血圧等)が見られます。 |
| 鋳型 | 1µl |
| 10×Gene Taq Universal Buffer | 5µl |
| dNTP | 4µl |
| プライマー(Forward, 20pmol/µl) | 1µl |
| プライマー(Reverse-NまたはM, 20pmol/µl) | 1µl |
| d.d.H2O | 37.75µl |
| Gene Taq NT | 0.25µl |
| Total | 50µl |
| 98°C | 1分 | |
| 98°C | 20秒 | 35サイクル |
| 60°C | 20秒 | |
| 72°C | 45秒 | |
| 72°C | 5分 |
|
Agarose 21 3% gelで泳動 |
Sample1ではReverse-Nのみ、Sample2ではReverse-N、Mの両方、Sample3ではReverse-Mのみバンドが確認できました。この結果から、Sample1がNN型(野生型ホモ)、Sample2がMN型(ヘテロ)、Sample3がMM型(変異型ホモ)であることが分かりました。
上記実験例で紹介しているプライマー配列の設計は、下記論文を参考にしました。
"Characterization of the three genotypes of low Km aldehyde dehydrogenase in a Japanese population."
T. Takeshita et al. Hum Genet (1994) 94:217-223
この論文ではPCRにより人工的な制限酵素サイトを導入しています。つまりReverseプライマーのTTCAC部位をTTCTCに変えて、そのPCR産物を制限酵素で処理することによりALDH2の遺伝子型を決定しています。
そのため、このReverseプライマー配列と、それに対応するALDH2のゲノム配列を比較すると、一塩基相補的でない部位があることが分かります（下記Tの部分）。
| ALDH2ゲノム： | 5'-GAA GTG AAA ACT GTG AGT GTG G-3' |
| Reverse プライマー (野生型) ： | 3'-CTT CTC TTT TGA CAC TCA CAC C-5' |
弊社では、制限酵素処理をせずにPCRのみで遺伝子型を決定するために、まず標的部位が確実に増えている上記論文のプライマー配列を参考にしました。そのため、上記論文で制限酵素サイトを導入するために入れたミスマッチ部位はそのまま残してあります。
上記のプライマーはALDH2のexon 12の全体を増幅します。NCBIのAccession No.はM20455です。なおALDH2全体についてはAH002599で情報を取得できます。
下記は2004.07.22現在のexon 12の情報です。最新の情報はNCBIのデータベースでご確認ください。塩基配列中のプライマー部位は下線で示してあります。
LOCUS HUMALDH12 135 bp DNA linear PRI 31-OCT-1994
DEFINITION Human nucleus-encoded mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2
(ALDH2) gene, exon 12.
ACCESSION M20455 J03043
VERSION M20455.1 GI:178387
KEYWORDS aldehyde dehydrogenase; aldehyde:NAD+ oxidoreductase;
nuclear-encoded mitochondrial EF-G-like protein.
SEGMENT 12 of 13
SOURCE Homo sapiens (human)
ORGANISM Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
REFERENCE 1 (bases 1 to 135)
AUTHORS Hsu,L.C., Bendel,R.E. and Yoshida,A.
TITLE Genomic structure of the human mitochondrial aldehyde dehydrogenase
gene
JOURNAL Genomics 2 (1), 57-65 (1988)
MEDLINE 88256152
PUBMED 2838413
REFERENCE 2 (sites)
AUTHORS Crabb,D.W., Edenberg,H.J., Bosron,W.F. and Li,T.K.
TITLE Genotypes for aldehyde dehydrogenase deficiency and alcohol
sensitivity. The inactive ALDH2(2) allele is dominant
JOURNAL J. Clin. Invest. 83 (1), 314-316 (1989)
MEDLINE 89093436
PUBMED 2562960
COMMENT Original source text: Human DNA (library of Y.-F.C.Lau), clones
pCV[105,108], and cDNA to mRNA, clones
ALDH2[105-1,105-2,105-20,108-12a].
[2] sites; allele ALDH2-2 variation.
Draft entry and printed copy of sequence for [1] kindly provided by
L.C.Hsu, 01-MAR-1988.
Many orientals lack the mitochondrial aldehyde dehydrogenase
(ALDH2) activity responsible for the oxidation of acetaldehyde
produced during ethanol metabolism. A substitution of lysine for
glutamate at amino acid position 487 produced by a point mutation
at position 114 (g->a) in the sequence below is the cause.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..135
/organism="Homo sapiens"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:9606"
/map="12q24.2"
gene join(M20444.1:162..721,M20445.1:1..125,M20446.1:1..162,
M20447.1:1..100,M20448.1:1..132,M20449.1:1..149,
M20450.1:1..134,M20451.1:1..123,M20452.1:1..204,
M20453.1:1..186,M20454.1:1..178,1..135,M20456.1:1..43)
/gene="ALDH2"
CDS join(M20444.1:601..714,M20445.1:11..115,M20446.1:11..151,
M20447.1:11..90,M20448.1:11..122,M20449.1:11..139,
M20450.1:11..124,M20451.1:11..113,M20452.1:11..194,
M20453.1:11..176,M20454.1:11..168,11..125,M20456.1:11..43)
/gene="ALDH2"
/EC_number="1.2.1.3"
/note="precursor"
/codon_start=1
/product="aldehyde dehydrogenase"
/protein_id="AAA51693.1"
/db_xref="GI:178390"
/db_xref="GDB:G00-119-668"
/translation="MLRAAARFGPRLGRRLLSAAATQAVPAPNQQPEVFCNQIFINNE
WHDAVSRKTFPTVNPSTGEVICQVAEGDKEDVDKAVKAARAAFQLGSPWRRMDASHRG
RLLNRLADLIERDRTYLAALETLDNGKPYVISYLVDLDMVLKCLRYYAGWADKYHGKT
IPIDGDFFSYTRHEPVGVCGQIIPWNFPLLMQAWKLGPALATGNVVVMKVAEQTPLTA
LYVANLIKEAGFPPGVVNIVPGFGPTAGAAIASHEDVDKVAFTGSTEIGRVIQVAAGS
SNLKRVTLELGGKSPNIIMSDADMDWAVEQAHFALFFNQGQCCCAGSRTFVQEDIYDE
FVERSVARAKSRVVGNPFDSKTEQGPQVDETQFKKILGYINTGKQQGAKLLCGGGIAA
DRGYFIQPTVFGDVQDGMTIAKEEIFGPVMQILKFKTIEEVVGRANNSTYGLAAAVFT
KDLDKANYLSQALQAGTVWVNCYDVFGAQSPFGGYKMSGSGRELGEYGLQAYTEVKTV
TVKVPQKNS"
intron <1..10
/gene="ALDH2"
/note="G00-119-668"
/number=11
exon 11..125
/gene="ALDH2"
/note="G00-119-668"
/number=12
variation 114
/gene="ALDH2"
/note="g in ALDH2-1 allele; a in ALDH2-2 allele"
intron 126..>135
/gene="ALDH2"
/note="G00-119-668"
/number=12
ORIGIN 3.7 kb after segment 11; chromosome 12q24.2.
1 caaattacag ggtcaactgc tatgatgtgt ttggagccca gtcacccttt ggtggctaca
61 agatgtcggg gagtggccgg gagttgggcg agtacgggct gcaggcatac actgaagtga
121 aaactgtgag tgtgg
//
ALDH2遺伝子は第12染色体長腕 (12q24.2) に位置し、44kbの塩基配列中に517個のアミノ酸をコードする少なくとも13個のエクソンを有しています。プロセシングを受けてシグナルペプチドが取り除かれるため、ALDH2の成熟タンパク質は500個のアミノ酸からなります。
ALDH2活性の欠損は主にALDH2遺伝子の点突然変異によるもので、ALDH2遺伝子の第12エクソンの114番目の塩基がG（グアニン）からA（アデニン）へ変異をおこしており、その結果、成熟タンパク質中の第487番目のアミノ酸がグルタミン酸（GAA）からリジン（AAA）に置換されています。
ISOHAIR
ISOHAIR Jr.
Gene Taq NT
Agarose 21
Marker
5
50×TAE
EtBr Solution