ISOGENを用いた骨からのRNA抽出

ISOGENを用いて下記のプロトコルでRat脊椎からのtotal RNA抽出を試み、得られたtotal RNAの収量と純度を測定しました。

Ratから脊椎を摘出し、付着している筋肉を、手早く、できるだけ除去した(注1)
↓
脊椎を液体窒素中で磨砕
↓
粉末状組織 0.5 g
↓←ISOGEN 5 ml
ポリトロンでホモジナイズ
↓
静置(室温、5分)(注2)
↓←クロロホルム 2 ml
強く混合(2分)
↓
静置(室温、3分)
↓
遠心分離(5,000 rpm、4°C、15分)
↓
上清を各サンプル 2.5 mlずつ回収
↓←イソプロパノール 2.5 ml(注3)
静置(室温、10分)
↓
遠心分離(5,000 rpm、4°C、10分)
↓
上清を除去
↓
75% エタノールで洗浄(2回)
↓
ddH2Oに溶解
↓
エタノール沈澱
↓
75% エタノールで洗浄(2回)
↓
ddH2O 300µlに溶解

OD260	OD280	OD260/280	収量(µg)
0.3878	0.1744	2.2241	466

吸光度測定方法
RNA溶液 1 µlを50mM Tris-HCl (pH8.0) 99 µlで希釈し、吸光度を測定

• (注1) : 完全には除去できず、わずかに筋肉が残った。
• (注2) : 室温での5分間の静置を[静置(室温、30分)→遠心分離(5,000 rpm、4°C、10分)→上清を回収]に変更した場合も、結果に大きな違いは生じなかった。
• (注3) : イソプロパノール 2.5 mlの代わりに、イソプロパノール 1.25 mlとHigh Salt Precipitation Solution 1.25 mlを添加した場合も、結果に大きな違いは生じなかった。High Salt Precipitation Solutionを加えたサンプルの中には、イソプロパノール沈殿後に結晶化してしまうものがあった。結晶は75% エタノールでの2回の洗浄では除けなかったが、ddH2Oに溶解し、再度エタノール沈殿を行うことで見えなくなった。