「ISOIL」のプロトコールを改変することでDNAの抽出効率が良くなった例をご紹介致します。さらに、抽出したDNAを鋳型にPCRでネコブセンチュウの検出を行った実験例もご紹介致します。
「ISOIL」は界面活性剤と熱処理の作用によりDNAを抽出しますが、「ISOIL for Beads Beating」はさらにビーズ破砕を行いますので、DNAの収量という点で両者を比較すると「ISOIL」の方が低くなる傾向があります。
この度、九州沖縄農業研究センター 線虫制御研究室の岩堀様は、「ISOIL」のプロトコールを改変することによりDNAの抽出効率を飛躍的に改善し、さらにそのDNAを鋳型に病害線虫であるネコブセンチュウをPCRで検出することに成功されました。
その改変プロトコールは「ISOIL」のDNA収量を上げる有効な手段であり、さらに「ISOIL」を利用した土壌DNA研究の応用にも期待がもてます。
土壌サンプル(0.5 g)を 2 mlチューブに入れる
↓凍結融解処理 （－20゜Cまたは－80゜C, 1時間）* 凍結後は室温で融解する
↓←スキムミルク 20mg（4%）
↓←950µl, Lysis Solution HE
↓←50µl, Lysis Solution 20S
↓十分に混合する
↓超音波処理 （28KHz, 200W, 3～10分間）
↓インキュベート(65゜C, 1時間) * 10分間隔で転倒混和する
↓凍結融解処理 （－20゜Cまたは－80゜C, 1時間） * 凍結後は室温で融解する
↓遠心(12,000×g, 1分間, 室温)
↓上清600µlを新しいチューブに移す
↓←400µl, Purification Solution
↓十分に混合する
↓←600µl, クロロホルム
↓ボルテックス, 15秒間
↓遠心(12,000×g, 15分間, 室温)
↓水層800µlを新しいチューブに移す
↓←800µl, Precipitation Solution
↓十分に混合する
↓遠心(20,000×g, 15分間, 4゜C)
↓上清を捨てる
↓←1ml, Wash Solution
↓数回転倒混和
↓遠心(20,000×g, 10分間, 4゜C)
↓上清を捨てる
↓←1ml, 70%エタノール
↓←2µl Ethachinmate
↓ボルテックス
↓遠心(20,000×g, 5分間, 4゜C)
↓上清を捨てる
↓風乾
↓←TE (pH 8.0)もしくはddH2O
DNA溶液
データ提供 : 独立行政法人 九州沖縄農業研究センター 地域基盤研究部 線虫制御研究室 室長 岩堀英晶様
「ISOIL」を標準プロトコールと改変プロトコールでそれぞれ使用し、抽出できたDNAの量で抽出効率を比較した。その結果、改変プロトコールによりDNAの抽出効率は飛躍的に上がった。土壌サンプルは、九州沖縄農業研究センター内サツマイモ圃場（熊本県菊池郡西合志町）の土壌（黒ボク土）を使用した。
改変プロトコールにて抽出されたDNAを鋳型にして、九州沖縄地域で主要な３種ネコブセンチュウ（サツマイモ、アレナリア、ジャワ）のミトコンドリア遺伝子を増幅させるプライマーでPCRを行ったところ、他生物のDNAに影響されることなくネコブセンチュウのDNAのみが増幅された。
上記３種いずれかのネコブセンチュウDNAが存在すれば、1.7kbのPCR産物が確認でき（下図左）、 制限酵素HinfI処理によってこれらに特徴的なバンドパターンが確認され、種の特定が可能となる（下図右）。
特異的プライマーによるネコブセンチュウの検出 |
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| 土壌サンプル １ ２ ３ ４ |
土壌サンプル １ ２ ３ ４ |
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| 1.7 kb→ |  |
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PCR産物 |
制限酵素 HinfIによる処理の結果 |
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プライマー配列(5'→3') |
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＊ PCRを行う上での注意点
・PCRの条件についてはHarris et al.(1990) Journal of Nematology 22,518-524の方法に準ずる。
・抽出されたDNAを50µlの滅菌蒸留水に溶解し、その0.2µl を鋳型として用いる。
・使用するTaq DNAポリメラーゼは、高感度増幅能を持つものを使用する。
これらの抽出・検出系におけるネコブセンチュウの検出感度について検討した。
土壌サンプルは、九州沖縄農業研究センター内サツマイモ圃場の土壌を1/5,000ワグネルポットに詰め、１作サツマイモを栽培後の土壌を使用した。
その結果、ベルマン法による抽出で約100頭/20g土壌レベルの汚染土壌で、ネコブセンチュウの検出が可能であることが分かった（下図）。
土壌DNAを用いたネコブセンチュウの検出感度 |
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２０ｇ土壌中の線虫密度 |
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10 |
0 |
010 |
10 |
² |
10 |
³ |
10 |
4 |
10 |
5 |
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1.7 kb→ |
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