ISOPLANTおよびISOPLANT IIを用いた米1粒からのDNA抽出

　ISOPLANTおよびISOPLANT IIを用いて玄米、精米、および米飯各1粒からDNAを抽出し、電気泳動およびPCRを行いました。

プロトコル

(1)DNA抽出

(1)-1. 試料の準備

• 玄米 : 富山県産コシヒカリの玄米1粒を厚く折り重ねた(4回折、16枚重ね)アルミホイルではさみ、ラジオペンチを用いて破砕した。
• 精米 : 富山県産コシヒカリの精米1粒を厚く折り重ねた(4回折、16枚重ね)アルミホイルではさみ、ラジオペンチを用いて破砕した。
• 米飯 : 富山県産コシヒカリの精米を炊飯し、その1粒を試料とした。米飯はSolution I中でピペットチップの先でつぶした。

(1)-2. 抽出操作

<ISOPLANT>

<ISOPLANT II>

米粒をペンチで粉砕(精米、玄米の場合) ↓ 米粉を1.5 ml tubeにいれる ↓←Solution I　300 µl ↓(米飯の場合 : ピペットの先でつぶす) ↓ボルテックス2秒 ↓←Solution II　150 µl ↓ボルテックス 5秒 ↓50°C, 15分間 ↓←Solution III　150 µl ↓ボルテックス 2秒 ↓氷上, 15分間 ↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 15分間) 上層(350 µl) ↓←2.5倍量EtOH (875 µl) ↓転倒混和 ↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 10分間) 沈澱 ↓70% エタノール洗浄 ↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 5分間) 沈澱 ↓乾燥 ↓←TE(pH 8.0) 50 µl DNA溶液(50 µl)

米粒をペンチで粉砕(精米、玄米の場合) ↓ 米粉を1.5 ml tubeにいれる ↓←(Wash Buffer 1 ml + 2-ME 5µl) ↓転倒混和 ↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 10分間) 沈澱 ↓←Solution I　300 µl + 2-ME 3 µl ↓(米飯の場合 : ピペットの先でつぶす) ↓ボルテックス2秒 ↓←Solution II　150 µl ↓ボルテックス 10秒 ↓50°C, 10分間 ↓←Solution III-A　100 µl ↓←Solution III-B　120 µl ↓ボルテックス 2秒 ↓氷上, 10分間 ↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 10分間) 上層(400 µl) ↓2倍量EtOH (800 µl) ↓転倒混和 ↓遠心(6,000 rpm, RT, 5分間) 沈澱 ↓70% エタノール洗浄 ↓遠心(6,000 rpm, RT, 1分間) 沈澱 ↓乾燥 ↓←TE(pH8.0) 50 µl DNA溶液(50 µl)

(2)PCR

玄米、精米、および米飯から抽出したサンプル0.5 µl 〜 2 µl を鋳型としてPCR(識別バンドM11の検出)を行い、抽出サンプルによるPCR阻害について確認した。
[参考資料(PCR)：公開特許公報 特開2001-95589 米試料の品種識別方法]

Primer Sequence
M11F20 gtc cac tgt gac cac aac at
M11R20 gtc cac tgt ggg gat tgt tc

Reaction Mixture

Component	Volume(µl)	Final Concentration
10×Gene Taq Universal Buffer	2.5 µl	1×
2.5 mM dNTP	2 µl	200 µM each dNTP
3 µM Primer Mixture	2.5 µl	300 nM
Gene Taq NT (5 U/µl)	0.2 µl	0.025 U/µl
Template	1 µl
H2O	14.8
Total	25 µl

PCR Cycle Setting

94 °C	2 min.
94 °C	1 min.	×35 Cycles
60 °C	1 min.
72 °C	2 min.

結果

1. 抽出したDNAのアガロースゲル電気泳動

玄米	精米	米飯
抽出DNA50 µlのうち20 µl(0.4粒分)をAgarose S 0.8% Gelで電気泳動 Lane 1 : Marker 1(λ/Hind III) Lane 2 : ISOPLANTで抽出したDNA溶液 Lane 3 : ISOPLANT II抽出したDNA溶液

 

2. PCR産物のアガロースゲル電気泳動

玄米	精米	米飯
PCR産物10 µlをAgarose S 0.8% Gelで電気泳動 Lane 1 : Marker 1(λ/Hind III) Lane 2 : no template control Lane 3 : template=ISOPLANTで抽出したDNA溶液 Lane 4 : template=ISOPLANT IIで抽出したDNA溶液

　ISOPLANT、ISOPLANT IIともに、米1粒からPCRを行うために十分な量のDNAを抽出できた。
　ISOPLANTで抽出したDNA溶液、ISOPLANT IIで抽出したDNA溶液ともに、PCRの鋳型DNAとして使用できた。