ISOPLANTおよびISOPLANT IIを用いて玄米、精米、および米飯各1粒からDNAを抽出し、電気泳動およびPCRを行いました。
(1)-1. 試料の準備
(1)-2. 抽出操作
<ISOPLANT>
米粒をペンチで粉砕(精米、玄米の場合)
↓
米粉を1.5 ml tubeにいれる
↓←Solution I 300 µl
↓(米飯の場合 : ピペットの先でつぶす)
↓ボルテックス2秒
↓←Solution II 150 µl
↓ボルテックス 5秒
↓50°C, 15分間
↓←Solution III 150 µl
↓ボルテックス 2秒
↓氷上, 15分間
↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 15分間)
上層(350 µl)
↓←2.5倍量EtOH (875 µl)
↓転倒混和
↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 10分間)
沈澱
↓70% エタノール洗浄
↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 5分間)
沈澱
↓乾燥
↓←TE(pH 8.0) 50 µl
DNA溶液(50 µl)
<ISOPLANT II>
米粒をペンチで粉砕(精米、玄米の場合)
↓
米粉を1.5 ml tubeにいれる
↓←(Wash Buffer 1 ml + 2-ME 5µl)
↓転倒混和
↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 10分間)
沈澱
↓←Solution I 300 µl + 2-ME 3 µl
↓(米飯の場合 : ピペットの先でつぶす)
↓ボルテックス2秒
↓←Solution II 150 µl
↓ボルテックス 10秒
↓50°C, 10分間
↓←Solution III-A 100 µl
↓←Solution III-B 120 µl
↓ボルテックス 2秒
↓氷上, 10分間
↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 10分間)
上層(400 µl)
↓2倍量EtOH (800 µl)
↓転倒混和
↓遠心(6,000 rpm, RT, 5分間)
沈澱
↓70% エタノール洗浄
↓遠心(6,000 rpm, RT, 1分間)
沈澱
↓乾燥
↓←TE(pH8.0) 50 µl
DNA溶液(50 µl)
玄米、精米、および米飯から抽出したサンプル0.5 µl 〜 2 µl を鋳型としてPCR(識別バンドM11の検出)を行い、抽出サンプルによるPCR阻害について確認した。
[参考資料(PCR):公開特許公報 特開2001-95589 米試料の品種識別方法]
Primer Sequence
M11F20 gtc cac tgt gac cac aac at
M11R20 gtc cac tgt ggg gat tgt tc
| Component | Volume(µl) | Final Concentration |
|---|---|---|
| 10×Gene Taq Universal Buffer | 2.5 µl | 1× |
| 2.5 mM dNTP | 2 µl | 200 µM each dNTP |
| 3 µM Primer Mixture | 2.5 µl | 300 nM |
| Gene Taq NT (5 U/µl) | 0.2 µl | 0.025 U/µl |
| Template | 1 µl | |
| H2O | 14.8 | |
| Total | 25 µl |
| 94 °C | 2 min. | |
| 94 °C | 1 min. | ×35 Cycles |
| 60 °C | 1 min. | |
| 72 °C | 2 min. | |
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| 玄米 | 精米 | 米飯 |
抽出DNA50 µlのうち20 µl(0.4粒分)をAgarose S 0.8% Gelで電気泳動
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| 玄米 | 精米 | 米飯 |
PCR産物10 µlをAgarose S 0.8% Gelで電気泳動
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ISOPLANT、ISOPLANT IIともに、米1粒からPCRを行うために十分な量のDNAを抽出できた。
ISOPLANTで抽出したDNA溶液、ISOPLANT IIで抽出したDNA溶液ともに、PCRの鋳型DNAとして使用できた。