ISOPLANTおよびISOPLANT IIを用いた米1粒からのDNA抽出

　ISOPLANTおよびISOPLANT IIを用いて玄米、精米、および米飯各1粒からDNAを抽出し、電気泳動およびPCRを行いました。

プロトコル

(1)DNA抽出

(1)-1. 試料の準備

• 玄米 : 富山県産コシヒカリの玄米1粒を厚く折り重ねた(4回折、16枚重ね)アルミホイルではさみ、ラジオペンチを用いて破砕した。
• 精米 : 富山県産コシヒカリの精米1粒を厚く折り重ねた(4回折、16枚重ね)アルミホイルではさみ、ラジオペンチを用いて破砕した。
• 米飯 : 富山県産コシヒカリの精米を炊飯し、その1粒を試料とした。米飯はSolution I中でピペットチップの先でつぶした。

(1)-2. 抽出操作

<ISOPLANT>
米粒をペンチで粉砕(精米、玄米の場合)
↓
米粉を1.5 ml tubeにいれる
↓←Solution I　300 µl
↓(米飯の場合 : ピペットの先でつぶす)
↓ボルテックス2秒
↓←Solution II　150 µl
↓ボルテックス 5秒
↓50°C, 15分間
↓←Solution III　150 µl
↓ボルテックス 2秒
↓氷上, 15分間
↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 15分間)
上層(350 µl)
↓←2.5倍量EtOH (875 µl)
↓転倒混和
↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 10分間)
沈澱
↓70% エタノール洗浄
↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 5分間)
沈澱
↓乾燥
↓←TE(pH 8.0) 50 µl
DNA溶液(50 µl)

<ISOPLANT II>

米粒をペンチで粉砕(精米、玄米の場合)
↓
米粉を1.5 ml tubeにいれる
↓←(Wash Buffer 1 ml + 2-ME 5µl)
↓転倒混和
↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 10分間)
沈澱
↓←Solution I　300 µl + 2-ME 3 µl
↓(米飯の場合 : ピペットの先でつぶす)
↓ボルテックス2秒
↓←Solution II　150 µl
↓ボルテックス 10秒
↓50°C, 10分間
↓←Solution III-A　100 µl
↓←Solution III-B　120 µl
↓ボルテックス 2秒
↓氷上, 10分間
↓遠心(12,000 rpm, 4°C, 10分間)
上層(400 µl)
↓2倍量EtOH (800 µl)
↓転倒混和
↓遠心(6,000 rpm, RT, 5分間)
沈澱
↓70% エタノール洗浄
↓遠心(6,000 rpm, RT, 1分間)
沈澱
↓乾燥
↓←TE(pH8.0) 50 µl
DNA溶液(50 µl)

(2)PCR

玄米、精米、および米飯から抽出したサンプル0.5 µl 〜 2 µl を鋳型としてPCR(識別バンドM11の検出)を行い、抽出サンプルによるPCR阻害について確認した。
[参考資料(PCR)：公開特許公報 特開2001-95589 米試料の品種識別方法]

Primer Sequence
M11F20 gtc cac tgt gac cac aac at
M11R20 gtc cac tgt ggg gat tgt tc

結果

1. 抽出したDNAのアガロースゲル電気泳動

玄米	精米	米飯
抽出DNA50 µlのうち20 µl(0.4粒分)をAgarose S 0.8% Gelで電気泳動 Lane 1 : Marker 1(λ/Hind III) Lane 2 : ISOPLANTで抽出したDNA溶液 Lane 3 : ISOPLANT II抽出したDNA溶液

2. PCR産物のアガロースゲル電気泳動

玄米	精米	米飯
PCR産物10 µlをAgarose S 0.8% Gelで電気泳動 Lane 1 : Marker 1(λ/Hind III) Lane 2 : no template control Lane 3 : template=ISOPLANTで抽出したDNA溶液 Lane 4 : template=ISOPLANT IIで抽出したDNA溶液

　ISOPLANT、ISOPLANT IIともに、米1粒からPCRを行うために十分な量のDNAを抽出できた。
　ISOPLANTで抽出したDNA溶液、ISOPLANT IIで抽出したDNA溶液ともに、PCRの鋳型DNAとして使用できた。

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