ISOGENを用いたグラム陽性菌からのRNA抽出

　グラム陽性菌は概して細胞壁が厚く、通常のプロトコルではRNAの収量がグラム陰性菌に比べて少なくなります。そこで、グラム陽性菌の細胞壁をガラスビーズで破壊後、ISOGENを用いてRNAを抽出しました。

[実験例]

グラム陽性菌(3ml培養)
↓遠心分離(10k×g、4°C、10分間)(1.5ml×2tube)
沈殿(*1)
↓←ISOGEN 300µl
↓←ガラスビーズ 0.1g
↓Vortex(2〜3分間、室温)(*2)
↓←ISOGEN 700µl(*3)
↓インキュベート(55°C、30分間)
↓遠心分離(10k×g、4°C、10分間)
上清
↓←クロロホルム 200µl
↓強く混合(15秒間)
↓静置(3分間、室温)
↓遠心分離(12k×g、4°C、15分間)(*4)
水相(500〜600µl)(*5)
↓←イソプロパノール 500µl
↓静置(5〜10分間、室温)
↓遠心分離(12k×g、4°C、15分間)
沈殿
↓←70% EtOH 1ml
↓遠心分離(7.5k×g、4°C、5分間)
沈殿
↓←乾燥後100µlのTEに溶解
Total RNA溶液

*1 : 可能な限り培地を除去
*2 : RNAの回収率が低い場合には、Vortexでの細胞壁の破壊を徹底することで改善できる。
*3 : この時点で、Sample : ISOGEN = 1 : 20になった。
*4 : 遠心分離によって、細胞壁、不溶性の細胞破片、ガラスビーズ、溶菌していない細胞を除去し、上清のみを新しいチューブに移す。不溶物が混入した場合、再度遠心分離を行う。
*5 : 水相はISOGEN量の60%程度になる。

[結果]

[実験例]の方法と通常のISOGEN処理で抽出したRNAの純度と収量、電気泳動写真は下記の通り。

菌名	抽出法法	OD260/280	RNA収量(µg)	写真
Nocardia otitidis caviarum	通常のISOGEN処理のみ	0.827	0.71	Lane 1
	ガラスビーズ+ISOGEN処理	1.618	4.70	Lane 2
Staphylococcus aureus PS96	通常のISOGEN処理のみ	0.866	0.74	Lane 3
	ガラスビーズ+ISOGEN処理	1.798	4.30	Lane 4

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