ISOGEN/ISOGEN-LSを用いた酵母からのRNA抽出例

　酵母は厚い細胞壁を持つため、通常のISOGEN/ISOGEN-LS処理のみで、RNAを効率良く回収するのは困難です。そこで、β-1,3結合のグルコースポリマーに作用するZymolyaseを用いて細胞壁を溶解し、RNA抽出を試みました。

プロトコル

yeast(1.5ml culture)
↓遠心分離(5k×g、4°C、5分間)
沈殿
↓←TE 1ml
↓Vortex
↓遠心分離(5k×g、4°C、5分間)
沈殿
↓←Buffer A^注) 200 µl
↓ Vortex
↓←Zymolyase-20T (1,000U/Buffer A 1ml) 20µl
↓インキュベート(30°C、30分間)
↓遠心分離(5k×g、4°C、10分間) *ISOGEN-LS の場合は省略
沈殿　 *ISOGEN-LS の場合は省略
↓←ペレットにISOGEN 1mlまたは 溶液 22 0µl に ISOGEN-LS 750 µl添加
↓放置(室温、5分間)
↓←Chloroform 200µl
↓強く撹拌(15秒間)
↓ 放置 ( 室温、 3 分間 )
↓ 遠心分離 (12k×g 、 4°C 、 15 分間 )
水層 (500µl)
↓←Isopropanol 500µl
↓放置(室温、5-10分間)
↓遠心分離(12k×g、4°C、10分間)
沈殿
↓←70% Ethanol 1ml
↓Vortex
↓遠心分離(7.5k×g、4°C、5分間)
沈殿
↓乾燥
↓←TE 100 µlに溶解
Total RNA溶液

注)Buffer A : 1M sorbitol, 100mM EDTA, 14mM 2-Mercaptethanol
Zymolyase処理無しの対照実験では、上記プロトコル中で下線、青文字(ex : Buffer A 200 µl)で示した操作を省きました。

結果

Total RNA溶液の電気泳動写真

Lane No. サンプル名 Zymolyase処理 抽出試薬 1 S. cerevisiae 無し ISOGEN 2 有り ISOGEN 3 ISOGEN-LS 4 S. pombe 無し ISOGEN 5 有り ISOGEN 6 ISOGEN-LS 1% ホルマリン変性アガロースゲル 100V、40分間泳動

サンプル名	Zymolyase処理	抽出試薬	OD260/280	RNA濃度(mg/ml)
S. cerevisiae	無し	ISOGEN	1.0	0.12
	有り	ISOGEN	1.7	1.8
		ISOGEN-LS	1.8	2.8
S. pombe	無し	ISOGEN	1.1	0.1
	有り	ISOGEN	1.8	2.1
		ISOGEN-LS	1.8	2.1