ISOGEN/ISOGEN-LSを用いた酵母からのRNA抽出例

　酵母は厚い細胞壁を持つため、通常のISOGEN/ISOGEN-LS処理のみで、RNAを効率良く回収するのは困難です。そこで、β-1,3結合のグルコースポリマーに作用するZymolyaseを用いて細胞壁を溶解し、RNA抽出を試みました。

プロトコル

yeast(1.5ml culture)
↓遠心分離(5k×g、4°C、5分間)
沈殿
↓←TE 1ml
↓Vortex
↓遠心分離(5k×g、4°C、5分間)
沈殿
↓←Buffer A 200 µl
↓←Zymolyase-20T (1,000U/Buffer A 1ml) 20µl
↓インキュベート(30°C、30分間)
↓遠心分離(5k×g、4°C、5分間)
沈殿
↓←ISOGEN 1mlまたはISOGEN-LS 750 µl
↓放置(室温、5分間)
↓←Chloroform 200µl
↓強く撹拌(15秒間)
↓放置(室温、5-10分間)
↓遠心分離(12k×g、4°C、10分間)
沈殿
↓←70% Ethanol 1ml
↓ボルテックス
↓遠心分離(7.5k×g、4°C、5分間)
沈殿
↓乾燥
↓←TE 100 µlに溶解
Total RNA溶液

注)Buffer A : 1M sorbitol, 100mM EDTA, 14mM 2-Mercaptethanol
Zymolyase処理無しの対照実験では、上記プロトコル中で下線、青文字(ex : Buffer A 200 µl)で示した操作を省きました。

結果

Total RNA溶液の電気泳動写真

Lane No. サンプル名 Zymolyase処理 抽出試薬 1 S. cerevisiae 無し ISOGEN 2 有り ISOGEN 3 ISOGEN-LS 4 S. pombe 無し ISOGEN 5 有り ISOGEN 6 ISOGEN-LS 1% ホルマリン変性アガロースゲル 100V、40分間泳動

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