ISOIL for RNA
土壌からのRNA抽出キットISOGEN II による夾雑物の除去
ISOIL for RNA プロトコールの「DNase 処理プロトコール」の代わりに、RNA抽出用試薬ISOGEN II を用いて核酸溶液を精製し、DNAおよび夾雑物の除去を行った。ISOIL for RNAマニュアルに掲載の通常プロトコール（RNA抽出プロトコール＋DNase処理プロトコール）では、土壌サンプルの種類によっては（特にアロフェン質黒ボク土において）、夾雑物質が除去しきれず、DNase処理等の酵素反応が阻害されることがある。その場合の対策として、ISOGEN II による精製を追加した方法を検討した。
実験例
土壌サンプル（アロフェン質黒ボク土）から、ISOIL for RNAのRNA抽出プロトコールに従ってRNAを抽出し、３通りの精製プロトコールを検討した。
① 通常プロトコール （RNA抽出＋DNase処理）
② オプションプロトコール1（ RNA抽出＋ ISOGEN II 処理）
③ オプションプロトコール2（ RNA抽出＋ ISOGEN II 処理＋DNase処理）
プロトコール（ RNA抽出、 ISOGEN II 処理、DNase処理）
RNA抽出 |
ISOGEN II 処理 |
DNase処理 |
土壌サンプル0.5 g をBeads Tube に入れる ↓←120 µl Sodium Silicofluoride Solution ↓←420 µl Lysis Solution R ↓←300 µl ﾌｪﾉｰﾙ/ｸﾛﾛﾎﾙﾑ/ｲｿｱﾐﾙｱﾙｺｰﾙ ↓←60 µl Lysis Solution 20S ↓ビーズビーティング（5 m/秒間, 30 秒間） ↓インキュベート（65°C, 2 時間） ↓遠心（12,000 x g, 5 分間, 室温） 水層450 µl を新しい2 ml 容チューブに移す ↓←450 µl Purification Solution R、ボルテックスで混合 ↓←450 µl クロロホルム、ボルテックスで15 秒間混合 ↓遠心（12,000 x g, 20 分間, 室温） 水層650 µl を新しい2 ml 容チューブに移す ↓←650 µl Precipitation Solution R、ボルテックスで混合 ↓遠心（20,000 x g, 15 分間, 4°C） ↓上清を除去し、沈殿を残す ↓←1 ml 70％～80%エタノール ↓←2 µl Ethachinmate、ボルテックスで混合 ↓遠心（20,000 x g, 5 分間, 4°C） ↓上清を除去したあと、沈殿を風乾 沈殿 【ISOGEN II 処理へ】 |
沈殿 ↓←1 ml ISOGEN II ↓ボルテックスで混合 ↓←400 µl RNaseフリー水、激しくシェイクして15秒間混合 ↓室温で10分間放置 ↓遠心（12,000 x g, 15分間, 4°C） 上清～950 µl を新しい2 ml 容チューブに移す ↓←950 µl （上清と等量の）イソプロパノール、転倒混和 ↓室温で10分間放置 ↓遠心（12,000 x g, 10分間, 4°C）、上清を除去 ↓←500 µl 75%エタノール、軽く転倒混和 ↓遠心（7,500 x g, 5 分間, 4°C）、上清を除去 ↓←500 µl 75%エタノール、軽く転倒混和 ↓遠心（7,500 x g, 5 分間, 4°C） ↓上清を除去したあと、沈殿を風乾 ↓←155 µl RNase フリー水で溶解 RNA溶液（155 µl） 【DNase処理へ】 |
RNA溶液（155 µl） ↓←5 µl Deoxyribonuclease（RT Grade） ↓←20 µl 10 x DNase（RT Grade）Buffer ↓←20µl 2 mg/ml BSA Solution ↓ピペッティングで軽く混合 ↓インキュベート（37°C, 15 分間） （以降マニュアル記載のとおり） ↓ﾌｪﾉｰﾙ/ｸﾛﾛﾎﾙﾑ/ｲｿｱﾐﾙｱﾙｺｰﾙ処理 二回 ↓クロロホルム処理 ↓エタノール沈殿 ↓70％エタノール洗浄 RNA溶液 |
得られたRNA溶液のアガロースゲル電気泳動
①～③の3通りの精製方法で得られた各4.7 µl のRNA溶液を アガロースゲル電気泳動に供した。
①通常プロトコール （RNA抽出＋DNase処理）
②オプションプロトコール1（RNA抽出＋ ISOGEN II 処理）
③オプションプロトコール2（RNA抽出＋ ISOGEN II 処理＋DNase処理）
Lane M：RNA Ladder
RT-PCR解析
①～③の3通りの精製方法で得られたRNA溶液と、10倍希釈したRNA溶液を鋳型にして、RT-PCRを行った（増幅サイズ： 0.5 kb, 1.4 kb）。また、ISOGEN II およびDNase処理の効果を確認するため、逆転写酵素なし（RT-）でのコントロール実験も行った。PCR産物を各3.3 ml アガロースゲル電気泳動に供した。
①通常プロトコール （RNA抽出＋DNase処理）
②オプションプロトコール1（ RNA抽出＋ ISOGEN II 処理）
③オプションプロトコール2（ RNA抽出＋ ISOGEN II 処理＋DNase処理）
増幅サイズ： 0.5 kb |
増幅サイズ： 1.4 kb |
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| Lane M：OneSTEP Marker 5 Lane 1 : RT－ Lane 2 : RT＋ Lane 3 : 10倍希釈 RT－ Lane 4 : 10倍希釈 RT＋ |
Lane M：OneSTEP Marker 6 Lane 1 : RT－ Lane 2 : RT＋ Lane 3 : 10倍希釈 RT－ Lane 4 : 10倍希釈 RT＋ |
結果
RT-PCRした結果、0.5 kbの増幅サイズにおいては、コントロール（RT-） の結果から③のISOGEN II 処理およびDNase処理を行う必要があることが分かった。 1.4 kbの増幅サイズにおいては、②のISOGEN II 処理だけで、コントロール（RT-） の増幅を抑えることができた。以上の結果より、アロフェン質黒ボク土のサンプルにおいて、RNA抽出用試薬ISOGEN IIを用いた精製はDNAおよび夾雑物の除去に有効であることが確認できた。
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