Thermostable β-Agarase 実験例

EtBr を含む 1% Agarose S / TAE により 200µg の λ-DNAを電気泳動した。
“λ-DNA を含むバンド部分のゲル”と “DNA を含まないウエル上部のゲル”を切り出して、 Thermostable β-Agarase を用いてアガロースゲルを分解した。 λ-DNA を含むアガロース分解溶液を 100 pg/µl まで希釈し、 PCR の鋳型 DNA とした。また、ウエル上部のアガロース分解溶液を PCR 反応液（50µl）に対し、 1/2倍量、 1/4倍量、 1/8倍量、 1/16倍量を含むように添加し、それぞれ同量（100pg）の鋳型 DNA で増幅した（1.1kbp）。

Lane M Marker 2 (λ/Hin d III ・ EcoR I double digest) Lane 1 Positive control Lane 2 アガロース分解溶液の持ち込み量　1/2 倍量 Lane 3 アガロース分解溶液の持ち込み量　1/4 倍量 Lane 4 アガロース分解溶液の持ち込み量　1/8 倍量 Lane 5 アガロース分解溶液の持ち込み量　1/16 倍量

＜結果＞
アガロースゲル電気泳動写真 Lane 2 と Lane 3 のバンドが Lane 1 のバンドと比べ薄くなっていることから、 PCR 反応液中に 1/4 倍量以上のアガロース分解溶液を持ち込むと PCR を阻害すると思われる。また、電気泳動の Buffer を TBE で同様の試験を行ったところ、 TAE と同様の結果であった。

＜考察＞
PCR 反応液に対し、Thermostable β-Agarase を用いた アガロース分解溶液の添加量を 1/8 倍量以下とすることをお勧めします。
（例： PCR 反応液の容量が 20µｌであれば、アガロース分解溶液の添加量を 2.5µｌ以下にする）

3％ Agarose 21 でλ-DNA 由来のPCR産物（500bp）を電気泳動し、ゲルブロックとして切り出した。 ゲルブロック150mg を90℃、5分間で完全に融解してから、65℃まで冷まして、本品6unitsを添加し、混和後、65℃、10分間でゲルを分解した。 1µl のベクター（3kbp, 50ng/µl ）に 9µl のDNA溶液（ゲル分解液）を加え Ligation-Convenience Kit を用いてライゲーション反応を行った。ライゲーション反応後、ECOS ™ Competent E. coli DH5αを形質転換し、生じたコロニー数を計測した。対照として、同様に回収した DNA溶液（ゲル分解液）をアルコール沈殿・精製し、得られた沈殿物を150µl のTE に溶解したDNA溶液を用いた。 ＜結果＞ ゲルブロックを分解した後のDNA溶液をそのままクローニングに用いた際のクローニング効率は80%で、分解後にアルコール沈殿・精製したDNA溶液を用いた際の効率は85%であった。ゲルブロック分解後のアルコール沈殿・精製の有無によるクローニング効率の差はわずかであった。

サンプルのDNA断片が100bp以下の短鎖の場合、一連の操作^* においてDNAの一本鎖へ解離が懸念されるため、短鎖DNA断片（100bp以下）におけるThermostable β-Agarase処理産物に関し、クローニングに対する影響を試験した。

*スタンダードタイプのアガロースゲルブロックから高温（95℃）でアガロースゲルブロックを融解後、酵素反応（50-65℃）によりアガロースを分解し、氷上にて再凝固しないか確認。

＜試験方法＞

①インサートDNAの調製	Xba I サイトを含むPrimerでλ-DNAを鋳型としたPCR増幅を行った。得られたPCR産物（GC含量44%）をXba Iで消化した（消化産物のサイズ：90bp）。
②アガロースゲルブロックの切り出し	①で得られた消化産物をアガロースゲル電気泳動（3% Agarose X ： 融点≦ 92℃）を行い、アガロースゲルブロック（160mg）を切り出した。
③アガロースゲルブロックからの核酸抽出	②のアガロースゲルブロック（160mg）を 2 つに分け（各80mg）、他社スピンカラムとThermostable β-Agarase を用いて、それぞれDNA溶液を得た。Thermostable β-Agarase処理は、95℃ 5分間でゲルブロックを溶解し、 55℃の恒温槽で5分間静置後、Thermostable β-Agarase 3units を添加し55℃で10分間インキュベーションした。その後、氷上にて静置しアガロースが完全に分解したことを確認した。
④クローニング	Xba I で消化し BAP(Bacterial Alkaline Phosphatase) 処理したpUC19をベクターとし、③で得られた各DNA溶液をインサートDNA として、モル比 1：3（ベクター ：インサート ≒ 3 ng ： 0.3 ng ）でライゲーション反応（各 n=3）を行い、E. coli DH5αを形質転換して、Blue/White Selection を行った。

＜結果＞	形質転換結果（n=3） ゲル抽出方法 青色 コロニー数 白色 コロニー数 白色 コロニー率（%） Thermostable β-Agarase 125 789 86 他社スピンカラム 138 786 85   Thermostable β-Agaraseで回収した短鎖DNA（90 bp）を用いてクローニングしても、 他社スピンカラムと比較してクローニング効率に大きな差は見られなかった。

＜考察＞
Thermostable β-Agarase処理の一連の操作において考えられるDNAの一本鎖へ解離は、 クローニング効率に与える影響が少ないと考えられる。

1µgのMarker 8 GTを 0.8% Agarose XPゲルで50V、90分間の電気泳動により分離し、166kbpから14kbpまでのDNA断片を含むバンドを250mgのゲルブロックとして切り出した。
65℃にて5分間保温しゲルブロックを融解してから、本品6unitsを添加してピペッティングで良く混和した後、さらに60℃にて10分間保温してアガロースゲルを分解した。
得られたDNAをチェックするため、アガロースゲル分解物の一部をそのまま0.3% Agarose Hゲルにアプライし、20V、16時間の電気泳動を行った。

＜結果＞
分子量の大きなDNA断片でもThermostable β-Agaraseを用いることで、せん断の少ないDNAを効率よく回収することができた。

制限酵素消化したプラスミドを1.5% 低融点タイプアガロースゲルで分離した。約0.8kbのバンドを100mgのゲルブロックとして切り出し、68℃にて5分間保温してゲルブロックを融解した。
本品6unitsを添加してピペッティングで良く混和した後、さらに68℃にて5分間保温しアガロースゲルを分解した。 *1
得られたDNA溶液（アガロース分解溶液）10µlまたは5µlを市販のSequencing Kitを用いてシークエンス反応に用いた。
市販Kitでプライマーを除去した後、減圧乾燥し、サンプルバッファーに溶解して全量を用いて塩基配列の解析（ABI 社製 377 シークエンサー）を行った。対照として、同様に切り出したゲルブロックから市販Kitを用いてDNA断片を精製し、水で溶出回収したものを用いた。

＜結果＞
アガロースゲル分解物を精製によって除去しなくても、除去した場合と同等の塩基配列解析結果が得られた。 *2

*1	Thermostable β-Agaraseは70℃で30分間加温しても10％以上活性が維持される。
*2	高濃度・高分子量のアガロース分解物が混入すると、解析機器の機種によっては故障の原因につながる可能性がある。高分子量のアガロースゲル分解物は遠心やフェノール・クロロホルム処理で除くことができる。
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