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製品説明

マツ材線虫病診断キット(24テスト用)


マツ材線虫病診断キット（96テスト用）

本キットは、LAMP法を利用してマツ材線虫病の病原体であるマツノザイセンチュウ (Bursaphelenchus xylophilus)を検出するキットです。LAMP法によりマツノザイセンチュウゲノムDNAの一部を増幅し、増幅の有無からマツノザイセンチュウの存在を判定します。

検出に必要な操作は、
①Bx抽出液 (キット添付) を用いてマツ材片からマツノザイセンチュウのDNAを抽出した後、
②DNAを検査溶液に添加して63°Cに60分間保温するのみであり、極めて簡便です。

判定にはDNA増幅の有無を蛍光発色液の発色の有無によって確認する目視判定法を採用しており、DNA増幅反応から検出までを同一反応チューブ内の完全閉鎖系で行うため、安全に短時間でマツノザイセンチュウゲノムDNAを検出することが可能です。

特長

抽出から検出までを備えたキット

DNA簡易抽出試薬を含むため、一連の操作を行うことができます。

シンプルな使用方法

DNAサンプルを検査溶液に添加して63°Cで1時間保温するだけで検査できます。

きわめて高感度な検査

微量なDNAサンプルからも正確に判定できます。

明確な判定方法

判定は蛍光の発色を採用していますので、簡単に陰性、陽性を判別できます (下図参照)。

検査環境の汚染リスクを低減

電気泳動などの操作による汚染の心配がありません。

リライアブル＆トレーサブルオリゴを使用

高信頼性オリゴヌクレオチドがプライマーとして含まれています。

陰性	陽性

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製品内容

マツ材線虫病診断キット （24テスト用、96テスト用）

構成品	24テスト用	96テスト用	保存	備考
検査用チューブ	24本	24本 x 4	室温
抽出用チューブ	24本	100本	室温
Bx 検査液	410 μl	410 μl x 4	-20°C遮光
Bx 酵素液	20 μl	20 μl x 4	-20°C遮光
蛍光発色液	20 μl	20 μl x 4	-20°C遮光
Bx 陽性コントロール	25 μl	25 μl x 4	-20°C遮光
ミネラルオイル	500 μl	500 μl x 4	-20°C遮光
Bx 抽出液	10 ml x 2	10 ml x 8	-20°C遮光

輸送方法

株式会社ニッポンジーンでは、ドライアイス梱包で製品をお届けいたします。 納品当日、製品を確実にお受取りいただき、到着次第できるだけ早く－20°Cフリーザーにて保存してください。

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使用例

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Q & A

マツ材片の採取方法について

本キットでは、対象とするマツ樹木の「幹」からマツ材片を採取します。直径 15 mm の木工用ドリルを用いて、幹の太さに応じて深さ 5 cm ないし 8 cm の穴を開けると材片を採取できます。採取するマツ材片に樹皮は不要です。

マツ材片の採取位置について

下記リンク先の資料によると、胸高部より上 (1 mほど) など高い位置から採ると陽性率が高いようです。^(文献13)
マツ成木におけるマツノザイセンチュウの樹体内分布ー病徴発症初期における効率的な検出のためにー (林野庁東北森林管理局様、外部サイトリンク)

ただし感染の初期は病徴 (枯れ) がなく、線虫は分散して低密度化している場合があるため注意が必要です。
キットを使用する場合、「一箇所だけでなく、複数箇所から材片を採ってみる」、「同じ位置から採取した材片で複数のテストをする」などの対処により取りこぼしは低減すると考えられます。
また、多くはマツノマダラカミキリが囓った摂食痕からマツノザイセンチュウが樹体内へ侵入しますが、産卵痕から侵入することもあります。そのため、マツノマダラカミキリによる産卵痕がサンプリング部位のひとつの目安になるかも知れません (産卵痕周辺への局在)^{(文献11、16)}。

検査時期について

材片採取は地域や時期によらず、枯れていると気付いたらその時に行うことをお勧めします (葉が赤く枯れ上がっていれば、検査の対象となります)。

関東以西の暖かい地域では、夏に感染すると秋には真っ赤に枯れてしまうため、秋に採取し確定のための検査を行います。
東北地方などでは気温が低く、病徴の進行が遅いため一年中枯れが発生します。寒い地域で感染後に年を越して枯れた場合 (年越し枯れ：年明けから 5、6月ごろまでに枯れた木)、線虫は検出されにくい傾向があります (全身に線虫が蔓延・拡散せず、一部に局在したままになるため)。

インキュベーター (恒温器) の代わりに使用できる安価な保温器はありませんか？

55˚Cや63˚Cの保温に魔法瓶 (真空断熱容器) を、94～100˚Cの保温には電気ポットや手鍋で沸騰させたお湯が使用可能です。魔法瓶には、ジャータイプなど広口の容器が扱いやすいです (400 ml 以上の熱湯を入れておくと60分間で1˚C程度しか低下しません)。

マイクロピペットなどの器具がありません。

本キットを用いる際に必要なマイクロピペットやピペットチップなどをまとめた「遺伝子検査ツールボックス」を eGenome Order サイトより販売しています。
遺伝子検査ツールボックス

株式会社ニッポンジーンでは「マツ材線虫病検査サービス」を提供しております。器具などがお手元になく、検体数が少ない場合、受託サービスのご利用をお勧めいたします。
マツ材線虫病検査サービス（10検体用）

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資料 Data Sheet

製品マニュアル

• マツ材線虫病診断キット 取扱説明書 (PDF)

SDS(Safety Data Sheet)

• マツ材線虫病診断キット 製品安全データシート (PDF)

リーフレット

• マツ材線虫病診断キット パンフレット (PDF)

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関連情報

備考

• 本品は試験研究用試薬です。医薬品の用途には使用しないでください。
• 本キットに含まれるプライマーは、全て「リライアブル＆トレーサブルオリゴ」を使用しています。「リライアブル＆トレーサブルオリゴ」は、株式会社ニッポンジーンマテリアルが製造する高信頼性オリゴヌクレオチド「リライアブルオリゴ」の一つです。
• LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) 法は、栄研化学株式会社により開発された日本産の等温遺伝子増幅法です。

参考文献

1. Prince AM, Andrus L. (1992) PCR: how to kill unwanted DNA. Biotechniques. 12 (3): 358
2. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12): e63
3. Aikawa T, Kikuchi T, Kosaka H. (2003) Demonstration of interbreeding between virulent and avirulent populations of Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae) by PCR-RFLP method. Appl. Entomol. Zool. 38 (4): 565
4. 相川 拓也 (2006) マツノザイセンチュウの伝播機構 -どのように媒介昆虫へ乗り移りそして離脱するのか- 日本森林学会誌 88 (5): 407
5. Kikuchi T, Aikawa T, Oeda Y, Karim N, Kanzaki N. (2009) A rapid and precise diagnostic method for detecting the Pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus by loop-mediated isothermal amplification. Phytopahology. 99 (12): 1365
6. 相川 拓也、神崎 菜摘、菊地 泰生 (2010) マツノザイセンチュウのDNAを利用した簡易なマツ材線虫病診断ツール”マツ材線虫病診断キット”について 森林防疫 59 (2): 60
7. 伊藤 英敏、神崎 菜摘、菊地 泰生 (2010) 家庭にある材料と診断キットによるマツ材線虫病診断 森林防疫 59 (2): 55
8. 相川 拓也 (2011) マツノザイセンチュウのDNAを利用した新しい診断法 –マツ材線虫病診断キット- 樹木医学研究 15 (2): 41
9. 木村 公樹、相川 拓也、山本 貴一、前原 紀敏、市原 優、今 純一、中村 克典 (2011) 青森県蓬田村に発生したマツ材線虫病被害木におけるマツノザイセンチュウの検出および媒介昆虫の加害状況. 東北森林科学会誌 16 (1): 7
10. Kanetani S, Kikuchi T, Akiba M, Nakamura K, Ikegame H, Tetsuka K (2011) Detection of Bursaphelenchus xylophilus from old discs of dead Pinus armandii var. amamiana trees using a new detection kit. Forest Pathology 41 (5): 387
11. 相川　拓也、中村　克典、市原　優、前原　紀敏、水田　展洋 (2013) 同一マツ枯死木から脱出したマツノマダラカミキリ成虫が保持するマツノザイセンチュウ数の変異－津波被害によって発生した枯死木の事例－. 森林防疫 62: 130
12. 青森県産業技術センター林業研究所 (2013) マツ材線虫病（松くい虫被害）の監視・防除対策 ～対策の手引き～. 地方独立行政法人青森県産業技術センターWebサイトURL: https://www.aomori-itc.or.jp/_files/00031745/pine_disease_manual.pdf
13. 中林 優季、松下 通也、星崎 和彦、相川 拓也 (2013) マツ成木におけるマツノザイセンチュウの樹体内分布ー病徴発症初期における効率的な検出のためにー. 林野庁東北森林管理局WebサイトURL: http://www.rinya.maff.go.jp/tohoku/sidou/pdf/24g16.pdf
14. 相川　拓也 (2014) 線虫学実験 (京都大学学術出版会): 66
15. 阿部　豊 (2016) ベールマン法とマツ材線虫病診断キットの応用と課題. グリーン・エージ 2016年6月号 (No. 510号)
16. 石黒 秀明、相川 拓也 (2016) マツノマダラカミキリの産卵痕を経由したアカマツ枯死木へのマツノザイセンチュウの侵入. 日本森林学会誌 98: 124
17. Hoshizaki K, Nakabayashi Y, Mamiya Y, Matsushita M (2016) Localized within- and between-tree variation in nematode distribution during latent state of pine wilt disease makes the disease status cryptic. Forest Pathology 46 (3): 200
18. 石黒 秀明、相川 拓也 (2018) マツノマダラカミキリの産卵痕からクロマツ枯死木へ侵入したマツノザイセンチュウの樹体内での分散とカミキリ成虫への乗り移り. 日本森林学会誌 100: 2

License

• LAMP法を用いたマツノザイセンチュウの検出法は、国立研究開発法人 森林研究・整備機構 森林総合研究所が特許を保有しています。株式会社ニッポンジーンは、LAMP法を用いたマツノザイセンチュウ検出の実施許諾を受けています。

関連製品

• 遺伝子検査ツールボックス （検査を行う為に必要な器具・消耗品類をまとめたセット）
• マツ材線虫病検査サービス （10検体用）

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