HeatAct LAMP MASTER シリーズ

LAMP法用核酸増幅試薬 HeatAct LAMP MASTER for Turbidity, for Fluorescence, for Turbidity (Visible Dye)
等温遺伝子増幅反応
品名 Code No. 包装単位 価格 備考
HeatAct LAMP MASTER for Fluorescence 311-09821 300反応用 60,800円 蛍光検出用
HeatAct LAMP MASTER for Turbidity 318-09831 300反応用 49,800円 濁度検出用
HeatAct LAMP MASTER for Turbidity (Visible Dye) 314-09811 1 Set 56,400円 目視判別用

製造元（株）ニッポンジーン

表示価格は希望納入価格 (税別) です。

製品説明

本品は、LAMP法による等温核酸増幅のためのマスターミックス試薬（2X）です。
蛍光検出用の「HeatAct LAMP MASTER for Fluorescence」と、 濁度検出用の「HeatAct LAMP MASTER for Turbidity」の2種類があります。
また、セット品である「HeatAct LAMP MASTER for Turbidity (Visible Dye)」では、 付属の目視判定試薬を添加することにより、増幅反応を目視で確認することが可能です。

特長

マスターミックスにプライマーと鋳型核酸を添加するだけの簡単操作 LAMP 法に必要な耐熱性鎖置換型DNAポリメラーゼ、Mg2+、dNTPs、至適化されたバッファーなどを含むため、2 x LAMP MASTERにプライマーと鋳型核酸を添加するだけでLAMP法によるDNA増幅を行うことができます。
（テンプレートDNA調製方法について実験例はこちら）

反応液調製時の非特異的増幅を抑制DNAポリメラーゼに特異的に結合するアプタマーにより、室温～50℃での酵素活性を抑制し、反応液調製時における非特異的増幅やプライマーダイマー形成を低減します。60～68℃でアプタマーが解離して酵素が活性化され、特異性の高い等温増幅が可能です。
（反応特異性について実験例はこちら）
（50℃でのDNAポリメラーゼ活性抑制について実験例はこちら）

ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に対する高い阻害耐性本品はSDSに対する耐性をもつため、SDSを含む簡易抽出液から得られた粗抽出核酸を鋳型として用いた場合でも、DNAの増幅が期待できます。
（実験例はこちら）

逆転写酵素を添加し、RT-LAMP可能RT-LAMPにおける50℃での逆転写反応など、柔軟な反応設計に対応します。逆転写酵素は別途ご用意ください。
（実験例はこちら）

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製品内容

蛍光検出用「HeatAct LAMP MASTER for Fluorescence」(300反応用)
構成品 容量 保存 備考
2 x HeatAct LAMP MASTER for Fluorescence 625 μl x 6本 -20°C遮光 本品のラベルに使用期限が表示されています。
励起波長：450-500 nm、最大487 nm
蛍光波長：480-560 nm、最大503 nm
濁度検出用「HeatAct LAMP MASTER for Turbidity」(300反応用)
構成品 容量 保存 備考
2 x HeatAct LAMP MASTER for Turbidity
 625 μl x 6本 -20°C 本品のラベルに使用期限が表示されています。

セット品

目視判別用「HeatAct LAMP MASTER for Turbidity (Visible Dye)」(1 Set)
構成品 容量 保存 備考
2 x HeatAct LAMP MASTER for Turbidity
 625 μl x 6本 -20°C 上記製品（濁度検出用） 包装
25 x Visible Dye
 300 μl x 1本 -20°C遮光  

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使用例

テンプレートDNA調製方法別の実験例

血液試料およびシロイヌナズナから、下記2種類の方法で調製したDNA溶液を鋳型として、本品（HeatAct LAMP Master for Fluorescence）を用いてLAMP反応を行った。テンプレートDNAの調製方法の違いがLAMP反応に及ぼす影響について比較検討した。

比較に使用したDNA抽出用試薬

結果　本品を用いることで、SDSを含む簡易抽出液で調製したDNAを鋳型とした場合においても、血液および植物試料のいずれからもLAMP反応による増幅が確認された。
一方、抽出方法および試料種によってCq値に差が認められたことから、試料対象に応じた前処理条件の最適化が有用である可能性が示された。


従来品との比較（反応特異性について）

反応特異性について評価するため、陽性コントロールプラスミドを添加したLAMP反応液（PC）および鋳型なしのLAMP反応液（NTC）を調製し、25℃で2時間保温した後、65℃で1時間反応させた。本品（HeatAct LAMP Master for Fluorescence）および従来品（LAMP Master for Fluorescence）について同一条件下で比較した。測定にはLight Cycler® 96を使用した。

結果　本品は、反応液調製時の非特異的増幅およびプライマーダイマー形成を低減しました。
アプタマーを含まない従来品では、25℃、2時間のNTC条件下において非特異的増幅が確認されました。 一方、本品はアプタマーの効果により、同条件下においても非特異的増幅産物は検出されませんでした。


50℃でのDNAポリメラーゼ活性抑制について

陽性コントロールプラスミドを添加したLAMP反応液（PC）および鋳型なしのLAMP反応液（NTC）を、以下の反応条件でLAMP反応を行った。アプタマーを含む他社製品（約45℃までの酵素活性を抑制）と本品（約50℃までの酵素活性を抑制）とで比較した。

反応条件

結果　本品は、他社製品と比較して高い温度（約50℃）まで酵素活性を効果的に抑制しました。
本品は、①および②の条件で同等の増幅が確認されました。 一方、他社製品では②の条件において、50℃保温中にDNAの増幅が進行したため、65℃での反応においてCq値は測定不能となり、さらにNTC条件において非特異的増幅が認められました。


RT-LAMP (1 Step / 2 Step) 条件の比較

Total RNAを鋳型とし、AMV Reverse Transcriptase を添加した以下の反応液組成にて RT-LAMP を実施した。 65℃で 1 時間反応させる 1 Step 条件と、逆転写酵素の至適温度に近い 50℃で10 分間逆転写反応を行った後、65℃で 1 時間反応させる 2 Step 条件を設定し、それぞれ 6 well で比較した。

＜反応液組成＞


＊ AMV Reverse Transcriptaseは、当社 20 U/µL 製品（Code No. 311-07501）を 1 U/µL に希釈してから添加した。

本品に逆転写活性はありません。RT-LAMPを行う場合は、必ず逆転写酵素を添加してください。
AMV Reverse Transcriptase　添加量：≧ 0.2 U／25 µL反応系
M-MLV Reverse Transcriptase　添加量：≧ 10 U／25 µL反応系

反応条件

結果　50℃、10分の逆転写ステップ追加により、鋳型RNA量が少ない条件においてRT-LAMPの再現性および感度が向上しました。
Total RNA 鋳型量が 20 pg/well の場合、1 Step RT-LAMP に比べ、2 Step RT-LAMP では増幅のばらつきが低減しました。また、Total RNA 鋳型量が 2 pg/well の条件では、1 Step RT-LAMP では 6 well 中 6 well すべてで増幅が認められなかったのに対し、2 Step RT-LAMPでは 6 well 中 3 well で増幅が確認されました。


SDS耐性評価

陽性コントロールプラスミドを添加したLAMP反応液に、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を終濃度0.01%、0.1%、0.2%となるよう添加し、65℃で1時間LAMP反応を行った。測定は LightCycler® 96 を使用した。

比較に使用したLAMP法用核酸増幅試薬

結果　本品は SDS に対して高い耐性を示し、SDS終濃度0.2%存在下においても増幅が認められました。 一方、従来品および他社製品では、SDS終濃度0.01%の条件においても増幅は認められませんでした。 本品は、SDS含有核酸抽出試薬から得られた粗抽出核酸を鋳型として使用できます。

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Q & A

蛍光検出に使用できる装置は？
リアルタイムPCR装置などが使用可能です。LAMP法用蛍光検出装置GENEMALも使用可能です。
目視判定に使用できるUV 照射装置は？
240-260 nm あるいは 350-370 nm の範囲の波長を出力するUV 照射装置が使用できます。
蛍光検出用試薬による増幅産物は、濁度測定装置で検出できますか？
HeatAct LAMP MASTER for Fluorescenceは、インターカレーターと耐熱性ピロホスファターゼを含むため、ピロリン酸の生成による不溶物質（白濁）の形成は起こりません。濁度測定装置では検出できませんので、リアルタイムPCR装置などの蛍光検出用装置をご利用ください。
濁度検出用試薬に25 x Visible Dyeを添加したあと、DNA増幅を濁度測定装置で検出できますか？
可能ですが、濁度測定の場合と目視判定の場合とで推奨のLAMP反応時間が異なります。反応時間を長くすることも可能ですが、その場合、陰性コントロールで非特異反応がないことを確認してください。

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資料 Data Sheet

製品マニュアル

SDS(Safety Data Sheet)

リーフレット

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関連情報

備考

関連製品

問い合わせ先

購入に関するお問い合わせ先
富士フイルム和光純薬株式会社および同社代理店・特約店
富士フイルム和光純薬株式会社　製品検索サイト
製品に関するお問い合わせ先
株式会社ニッポンジーン　企画開発部

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