dA-overhang reaction Mix
dA付加反応試薬| 品名 | Code No. | 包装単位 | 価格 | 備考 |
|---|---|---|---|---|
| dA-overhang reaction Mix | 313-08781 | 25 µl（25回用） | 13,000円 |
製造元 （株）ニッポンジーン
表示価格は希望納入価格 (税別) です。
製品説明
「Go-to DNA Polymerase」等のα型の高正確性PCR酵素は、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を有するため、得られるPCR産物は平滑末端です。
このPCR産物をTAクローニングするためには、3’末端にdAを付加する必要があります。
本品は、平滑末端のPCR産物にdAを簡便に付加するための10 x 反応液です。
本品でdAを付加したPCR産物は、そのままTAクローニングに用いることができます。
特長
平滑末端のPCR産物にdAを付加 反応は65℃で10分間のみ dAを付加したPCR産物はそのままTAクローニングに使用可能用途
- TAクローニング（TA-Enhancer Cloning Kit）
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製品内容
使用回数
25回用（10 μl反応系での使用回数です。）
| 構成品 | 容量 | 保存 | 備考 |
|---|---|---|---|
| dA-overhang reaction Mix | 25 µl | -20°C | 10 x 反応液 |
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使用例
I. インサートDNA の調製
- α 型PCR 酵素「Go-to DNA Polymerase」等を用いて、目的の配列を増幅します。
- 反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供して、増幅産物の確認を行います。
- 精製キット「ISOSPIN PCR Product」または「ISOSPIN Agarose Gel」等を用いて、PCR 産物の精製を行います。
II. dA 付加反応
- 新しいチューブに以下の比率で反応液を調製し、良く混合して下さい。
反応液組成 dA-overhang reaction Mix 1 μl 精製したPCR 産物 9 μl Total 10 μl - 反応液を65℃で10 分間反応させます。
- 反応液は、そのままライゲーションに用いることができます。（dA 付加反応は、ライゲーションの直前に行うようにして下さい。）
実験例1 dA付加反応の有無によるTAクローニングの効率比較
α型高正確性PCR酵素である「Go-to DNA Polymerase」で増幅した平滑末端のPCR産物（3 kb）を「dA-overhang reaction Mix」によりdA付加し、「TA-Enhancer Cloning Kit」を用いてTAライゲーション反応を行った。反応後、「ECOSTM Competent E. coli JM109」へ形質転換した。dA付加反応をしていないPCR産物をコントロールとして、コロニー数を計測して比較した。
結果
本品でdA付加したPCR産物を効率よくTAクローニングすることができた。
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Q & A
- 反応液をすぐライゲーションに用いましたが、効率が悪いです。
- 効率が悪い場合はTベクターとインサートとのモル比を最適化して下さい。「TA-Enhancer Cloning Kit」を用いる場合は、反応液の持ち込みを4 μl 以下にして下さい。
「TA-Enhancer Cloning Kit」を用いる場合の調製例
1. インサート DNA の調製：精製したPCR 産物の一部を ddWater または TE（pH8.0）で適した濃度に希釈します。
| インサートDNAの長さ | 20 µlの系でpANT Vector（2.7 kbp, 25 ng/µl）を1.8 µl使用した場合 |
|---|---|
| 500 bp | 46 ng/μl（pANT Vector とのモル比を1：5にするため） |
| 1 kbp | 37 ng/μl（pANT Vector とのモル比を1：2にするため |
| 3 kbp | 55 ng/μl（pANT Vector とのモル比を1：2にするため） |
2. dA付加反応液を調製（Total 10 μl：dA-overhang reaction Mix 1 μl, 希釈済み精製PCR産物 9 μl）、65℃で10 分間反応させます。
3. 以下の内容でライゲーション液(Total 20 μl)を調製します。
| pANT Vector (25 ng/µl) | 1.8 μl | (final conc. 45 ng/20 μl) |
|---|---|---|
| 5 x Ligation Mix | 4 μl | (final conc. 1X) |
| 10 x Enhancer Solution | 2 μl | (final conc. 1X)※ |
| Insert DNA（dA付加反応液） | 1 μl | |
| d.d. Water | 11.2 μl | (Total 20 μlにする) |
※ 添加する10 x Enhancer Solution の量は正確にはかりとって下さい。推奨量より多く添加したり、少なく添加したりするとライゲーション効率が著しく低下する場合があります。
4. ライゲーション反応液を 16°C で 30 分間反応させます。
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資料 Data Sheet
製品マニュアル
SDS(Safety Data Sheet)
リーフレット
- Go-to DNA Polymerase、TA-Enhancer Cloning Kit、dA-overhang reaction Mix パンフレット(PDF)
- TA-Enhancer Cloning Kit パンフレット(PDF)
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関連情報
備考
- 本品は試験研究用試薬です。医薬品の用途には使用しないでください。
関連製品
- TA-Enhancer Cloning Kit
- Go-to DNA Polymerase
- ISOSPIN PCR Product
- ISOSPIN Agarose Gel
- ECOSTM Competent E. coli シリーズ コンピテントセル
- TE (pH 8.0)
- Distilled Water, Deionized, Sterile 脱イオン蒸留水
- アガロースゲル電気泳動用試薬
- 購入に関するお問い合わせ先
- 富士フイルム和光純薬株式会社および同社代理店・特約店
- 富士フイルム和光純薬株式会社 製品検索サイト
- 製品に関するお問い合わせ先
- 株式会社ニッポンジーン 学術営業課
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