FRED Assay Kit

DNA断片化測定キット
品名 Code No. 包装単位 価格 備考
FRED Assay Kit for Plant DNA 310-08671 1 kit 54,000円 植物用

製造元 (株)ニッポンジーン

表示価格は希望納入価格 (税別) です。

製品説明

本製品は、標的配列の長さが異なる2種類のPrimer & Probeを用いてリアルタイムPCRを行い、得られたCt値を比較することで、植物DNAの断片化の程度を定量的に評価するためのキットです。

本製品は、FRED (Fragmentation analysis using multiple Real-time PCRs with Equivalent amplification efficiency and Different amplicon sizes) 法と呼ばれる分析技術を採用しており、DirectAce qPCR Mix Plus ROX Tubeとの組合せで、断片化の程度を示すDNA断片化指数を算出することが可能です。 加工食品等、DNAが断片化した試料を対象とした遺伝子検査を行う際に、断片化指数はDNAの品質の指標として利用することができます。

FRED法によるDNA断片化測定の原理

数値化

標的配列の長さが異なる2 種類のPrimer & Probe を用いてリアルタイムPCR を行うと、鋳型DNA の断片化の程度に応じて、標的配列の長い増幅曲線の立ち上がりが遅れ、2 つの増幅曲線のCt 値に差が生じます。

2 つの増幅曲線のCt 値の差から、100 bp の標的DNA のうち、断片化して鋳型にならないDNA の割合を示す理論値であるDNA 断片化指数 【DFI: DNA Fragmentation Index】を算出し、鋳型DNA の断片化の程度を数値化します。


特長

リアルタイムPCRのCt値から断片化の程度を定量的に評価 算出した断片化指数は、DNAの品質指標として利用できる

【注意事項】

・ 本製品では、リアルタイムPCR装置のUp Ramp Rate および Down Ramp Rate を「1.6℃ / sec」に設定する必要があります。
ご利用の前に、お手持ちのリアルタイムPCR装置で設定できるかご確認ください。
(ABI Prism® 7900 および ABI Prism® 7500 の場合、Ramp Rate を変更せず、Standard Mode を使用します。)

・ 本製品は「DirectAce qPCR Mix Plus ROX Tube」と組合せて使用することを前提として設計されたキットです。他のリアルタイムPCR 試薬ではご使用になれません。本製品をご使用される際は別途「DirectAce qPCR Mix Plus ROX Tube」(Code No. 318-07751)をお買い求め下さい。

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製品内容

使用回数

1回毎に1サンプルずつプレミックスを調製する場合、本キットは15サンプル分に相当します。
(1回毎に10サンプルずつプレミックスを調製する場合、本キットは30サンプル分に相当します)

保存方法

-20°C(遮光)

FRED Assay Kit for Plant DNA (1 kit)
構成品 容量 備考
No Fragmentation Control 300 µl x 1 コントロール用プラスミドDNA溶液(以下、「NFC」)
P100 Primer & Probe Mix 900 µl x 1 オリゴDNA溶液(約100 bp増幅)
P200 Primer & Probe Mix 900 µl x 1 オリゴDNA溶液(約200 bp増幅)
P400 Primer & Probe Mix 900 µl x 1 オリゴDNA溶液(約400 bp増幅)

本製品に、DNA抽出キット「GM quicker 4」、リアルタイムPCR試薬「DirectAce qPCR Mix Plus ROX Tube」、NTC(No Template Control)用溶液「TE(pH8.0)」等の試薬は含まれておりません。別途ご用意ください。

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使用例

DNA断片化指数(DFI, DNA fragmentation index)の算出

DNA断片化指数(DFI)は、ゲノムDNAに切断が生じている割合を100塩基単位で算出した理論値である(0以上1以下)

DFIの算出

Data 1: FRED Assay Kit for Plant DNAを使用した味噌DNAの断片化評価(P100とP400の組み合わせでDFIを算出)

方法

  1. 味噌から加工食品用DNA抽出キット「GM quicker 4」を用いてDNAを抽出し、得られた溶出液をサンプル用鋳型DNAとして使用した。
  2. 本キットから「NFC」(コントロール用鋳型DNA)と「P100」と「P400」のPrimer & Probe Mixのチューブを取り出して使用した。
  3. リアルタイムPCR試薬「DirectAce qPCR Mix Plus ROX Tube」を用いて 2 種類のPrimer & Probe Mix でそれぞれプレミックスを調製して小分けした後、各DNA溶液を混合して反応溶液を用意し、96 ウェルのPCR プレートへ分注してリアルタイムPCRを行った。(使用機種:ABI7500)
  4. 反応終了後、解析を行い、各ウェルのCt 値が算出されていることを確認した。 納豆DNAを鋳型にしたCt値

DNA 断片化指数(DFI, DNA fragmentation index)の算出

  1. NFC を2 種類のPrimer & Probe Mix で増幅させた際のCt 値の差「⊿Ct(NFC)」を求めた。
    ⊿Ct(NFC)=Ct(P400)-Ct(P100)=22.86-23.19-0.33
  2. サンプルを2 種類のPrimer & Probe Mix で増幅させた際のCt 値の差「⊿Ct(Sample)」を求めた。
    ⊿Ct(Sample)=Ct(P400)-Ct(P100)=36.74-27.349.4
  3. ⊿Ct(Sample)から⊿Ct(NFC)を引いた「⊿⊿Ct」を求めた。
    ⊿⊿Ct=⊿Ct(Sample)-⊿Ct(NFC)=9.4-(-0.33)9.73
  4. 得られた⊿⊿Ct から「DNA 断片化指数(DFI)」を求めた。
    DFI0.894 【エクセル関数の例:"=1-POWER(1/2, 9.73/3)"】 DFI計算式

結果

味噌DNA(1サンプル)の断片化指数DFIは「0.894」だった。

DFI は0~1 の値で算出される。「DFI = 0.894」と算出された場合、理論上、鋳型DNA 溶液中に含まれる100 bp の標的DNA のうち、約9割のDNA が断片化して PCR の鋳型にならない状態であることを示している。

Data 2: 加熱処理したトウモロコシDNAの断片化評価

加熱処理したトウモロコシDNA溶液を鋳型にリアルタイム PCR を行い、植物用キット「FRED Assay Kit for plant DNA」のP100とP400の組み合わせでそれぞれDFIを算出した(下図のDFIは、2回測定の平均)。

加熱時間の比較 

結果 サンプルの加熱時間と連動してDFI値が増加した。

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Q & A

どのPrimer & Probe の組合せで評価したらよいですか。
「DirectAce qPCR Mix Plus ROX Tube」以外のPCR試薬は使用できますか。
96ウェルPCRプレートの代わりに 8 連チューブなどは使用できますか。
植物種によって測定できないことはありますか。
DNA濃度が変わると測定結果に差はありますか。
機種の異なるリアルタイムPCR装置を使用しても、DFI値は同じになりますか。

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資料 Data Sheet

製品マニュアル

SDS(Safety Data Sheet)

リーフレット

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関連情報

License

備考

参考文献

関連製品

問い合わせ先

購入に関するお問い合わせ先
富士フイルム和光純薬株式会社および同社代理店・特約店
製品に関するお問い合わせ先
株式会社ニッポンジーン 学術営業課

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