ISOGEN、ISOGEN-LS

RNA抽出用試薬

ISOGEN/ISOGEN-LSを用いた酵母からのRNA抽出

酵母は厚い細胞壁を持つため、通常のISOGEN/ISOGEN-LS処理のみで、RNAを効率良く回収するのは困難です。そこで、β-1,3結合のグルコースポリマーに作用するZymolyaseを用いて細胞壁を溶解し、RNA抽出を試みました。また、Zymolyase処理の有無を比較することでその効果を検証しました。

プロトコール

yeast(1.5ml culture)
  ↓  遠心分離(5k x g、4°C、5分間)  
沈殿
  ↓ ←TE 1 ml  
  ↓ Vortex  
  ↓ 遠心分離(5k x g、4°C、5分間)  
沈殿
  ↓ ←Buffer A*1 200 µl Zymolyase処理無しの対照実験では、黄色で示した操作を省く。
  ↓  Vortex
  ↓ ←Zymolyase-20T (1,000U/Buffer A 1 ml) 20 µl
  ↓ インキュベート(30°C、30分間)
  ↓ 遠心分離(5k x g、4°C、10分間) * ISOGEN-LS の場合は省略
沈殿 * ISOGEN-LS の場合は省略
  ↓ ←ペレットにISOGEN 1 mlまたは 溶液 220 µl に ISOGEN-LS 750 µl添加  
  ↓ 放置(室温、5分間)  
  ↓ ←Chloroform 200 µl  
  ↓ 強く撹拌(15秒間)  
  ↓  放置 ( 室温、 3 分間 )  
  ↓  遠心分離 (12k x g 、 4°C 、 15 分間 )  
水層 (500 µl)
  ↓ ←Isopropanol 500 µl  
  ↓ 放置(室温、5-10分間)  
  ↓ 遠心分離(12k x g、4°C、10分間)  
沈殿
  ↓ ←70% Ethanol 1 ml  
  ↓ Vortex  
  ↓ 遠心分離(7.5k x g、4°C、5分間)  
沈殿
  ↓ 乾燥  
  ↓ ←TE 100 µlに溶解  
Total RNA溶液

 

*1 Buffer A : 1M sorbitol, 100mM EDTA, 14mM 2-Mercaptethanol

 

結果

上記のプロトコールで抽出したTotal RNAの電気泳動結果は下記の通り。

1% ホルマリン変性アガロースゲル
100V、40分間泳動
レーン
菌名
Zymolyase処理
抽出試薬
OD260/280
RNA濃度(mg/ml)
Lane ①
S. cerevisiae
無し
ISOGEN
1
0.12
Lane ②
有り
ISOGEN
1.7
1.8
Lane ③
ISOGEN-LS
1.8
2.8
Lane ④
S. pombe
無し
ISOGEN
1.1
0.1
Lane ⑤
有り
ISOGEN
1.8
2.1
Lane ⑥
ISOGEN-LS
1.8
2.1

 

 

 


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